Morfologia e Populações de Células Dendríticas

As células dendríticas (CD) são encontradas nos órgãos linfoides, nos epitélios da pele e dos tratos gastrointestinal e respiratório, bem como no interstício da maioria dos órgãos parenquimatosos. Essas células (introduzidas no Cap. 2) são identificadas morfologicamente pelas suas projeções membranosas ou semelhantes a espinhos (Fig. 6-4). Acredita-se que todas as CD surgem de precursores da medula óssea, e a maioria está relacionada, quanto à sua linhagem, aos fagócitos mononucleares (Fig. 2-2). Foram identificados vários subtipos de CD, que podem ser diferenciados pela expressão de vários marcadores de superfície celular e que podem desempenhar funções diferentes nas respostas imunes. Os dois tipos principais são denominados CD convencionais e as CD plasmocitoides (Tabela 6-3).

FIGURA 6-4 Células dendríticas. A, Micrografia óptica de células dendríticas cultivadas, derivadas de precursores da medula óssea. B, Micrografia eletrônica de varredura de uma célula dendrítica, mostrando as extensas projeções da membrana. C, D, Células dendríticas na pele, ilustradas de modo esquemático (C) e em um corte da pele (D) marcada com um anticorpo específico para as células de Langerhans (que aparecem em azul nessa coloração imunoenzimática). E, F, Células dendríticas em um gânglio lnfático, ilustrado de modo esquemático (E), e em um corte de gânglio linfático de camundongo (F) marcado com anticorpos marcados com fluorescência contra células B nos folículos (verde) e células dendríticas na zona de células T (vermelho). (A, B e D, cortesia de Dr. Y-J Liu, M.D. Anderson Cancer Center, Houston, Texas; F cortesia das Dras. Kathryn Pape e Jennifer Walter, University of Minnesota School of Medicine, Minneapolis.)

TABELA 6-3 Os Principais Subtipos de Células Dendríticas

Foram descritos outros subtipos de células dendríticas com base na expressão de vários marcadores de superfície (como CD4, CD8 e CD11b) ou na sua migração dos locais teciduais (células dendríticas do tipo Langerhans dos epitélios e células dendríticas intersticiais dos tecidos). Observe que todas as CD expressam moléculas do MHC de classe II. Alguns pesquisadores também descrevem células dendríticas derivadas dos monócitos, que podem ser geradas de monócitos circulantes cultivados com várias citocinas e que podem desenvolver-se in vivo durante reações inflamatórias.

As CD que migram dos tecidos para os gânglios linfáticos também podem ser caracterizadas como células imaturas ou maduras. Muitas CD que normalmente residem nos órgãos linfoides e em tecidos não linfoides, incluindo os epitélios, parecem estar, na ausência de infecção ou de inflamação, em um estado imaturo, isto é, capaz de capturar antígenos, porém incapaz de ativar as células T. Essas CD podem atuar na apresentação de autoantígenos às células T autorreativas, causando, assim, a inativação ou morte das células T ou gerando células T reguladoras. Esses mecanismos são importantes para a manutenção da autotolerância e prevenção da autoimunidade (Cap. 14). Conforme discutido adiante, as CD que encontraram micro-organismos sofrem maturação e funcionam para apresentar os antígenos às células T e ativá-las.

Captura e Transporte do Antígeno pelas Células Dendríticas

As CD que residem nos epitélios e nos tecidos capturam antígenos proteicos e os transportam até os gânglios linfáticos regionais (drenantes) (Fig. 6-5). As CD em repouso (imaturas) expressam receptores de membrana, como lectinas do tipo C, que se ligam aos micro-organismos. As CD utilizam esses receptores para a captura e endocitose dos micro-organismos e seus antígenos e, em seguida, para o processamento das proteínas ingeridas em peptídeos capazes de se ligar a moléculas do MHC. Além da endocitose mediada por receptor e fagocitose, as CD podem ingerir antígenos por micropinocitose e macropinocitose, processos que não envolvem receptores de reconhecimento específicos, mas que capturam qualquer material que possa se encontrar na fase líquida na vizinhança das CD. Ao mesmo tempo, verifica-se o desenvolvimento de uma resposta imune inata durante a qual os produtos microbianos são reconhecidos por receptores semelhantes a Toll e outros sensores microbianos nas CD e outras células. As CD são ativadas por esses sinais e por citocinas, como o fator de necrose tumoral (TNF), que são produzidas em resposta aos micro-organismos. As CD ativadas (também denominadas CD maduras) perdem a sua aderência aos epitélios ou tecidos e migram para os gânglios linfáticos. As CD também começam a expressar um receptor de quimiocinas, denominado CCR7, que é específico para duas quimiocinas, CCL19 e CCL21, que são produzidas nas zonas de células T dos gânglios linfáticos. Essas quimiocinas atraem as CD que transportam antígenos microbianos para dentro das zonas de células T dos gânglios linfáticos regionais. As células T virgens também expressam CCR7, e esta é a razão pela qual as células T virgens migram para as mesmas regiões dos gânglios linfáticos onde estão concentradas as CD que transportam antígenos (Cap. 3). A colocalização das CD que transportam antígenos e das células T virgens maximiza a probabilidade do encontro do antígeno com células T que possuem receptores para este antígeno. A maturação também converte as CD, de células cuja função é capturar antígenos, em células capazes de apresentar antígenos às células T virgens e ativá-las. As CD maduras expressam altos níveis de moléculas do MHC com peptídeos ligados, bem como coestimuladores necessários para a ativação das células T. Por conseguinte, quando essas células tornam-se residentes nos gânglios linfáticos, elas já se desenvolveram em APC potentes com a capacidade de ativar os linfócitos T. As células T virgens que recirculam através dos gânglios linfáticos encontram essas APC, e as células T que são específicas para os complexos de peptídeo-MHC apresentados são ativadas. Esta é a etapa inicial na indução das respostas das células T a antígenos proteicos.

FIGURA 6-5 Papel das células dendríticas na captura e apresentação de antígenos. As células dendríticas imaturas na pele (células de Langerhans) ou na derme (CD dérmicas) capturam antígenos que entram pela epiderme e os transportam até os gânglios linfáticos regionais. Durante essa migração, as células dendríticas amadurecem e transformam-se em APC eficientes. A tabela fornece um resumo de algumas das alterações observadas durante a maturação das células dendríticas, que são importantes no desempenho das funções dessas células.

Os antígenos também podem ser transportados até os órgãos linfoides na forma solúvel. As CD residentes nos gânglios linfáticos e no baço podem capturar antígenos transportados na linfa e no sangue, respectivamente, e também são estimuladas a amadurecer pelos produtos microbianos. Quando a linfa entra em um gânglio linfático através de um vaso linfático aferente, ela drena no seio subcapsular, e parte da linfa entra nos condutos de células reticulares e fibroblastos que se originam do seio e atravessam o córtex (Cap. 2). Uma vez nos condutos, os antígenos de baixo peso molecular podem ser capturados por CD cujos processos se interdigitam entre as células reticulares. Outros antígenos no seio subcapsular são captados por macrófagos e CD, que transportam os antígenos no córtex. As células B no gânglio linfático também podem reconhecer e internalizar antígenos solúveis. As CD, os macrófagos e as células B que capturaram antígenos proteicos podem então processá-los e apresentá-los a células T virgens e a células T efetoras que foram geradas por estimulação antigênica prévia.

A coleta e a concentração de antígenos estranhos nos gânglios linfáticos são suplementadas por duas outras adaptações anatômicas que desempenham funções semelhantes. Em primeiro lugar, as superfícies de mucosas dos sistemas gastrointestinal e respiratório, além de serem drenadas por capilares linfáticos, contêm coleções especializadas de tecido linfoide secundário que podem coletar diretamente o conteúdo luminal desses órgãos, tendo então acesso ao material antigênico. Entre esses órgãos linfoides da mucosa, os mais bem caracterizados são as placas de Peyer do íleo e as tonsilas faríngeas (Cap. 13). Em segundo lugar, a corrente sanguínea é monitorada por APC no baço à procura de quaisquer antígenos que tenham alcançado a circulação. Esses antígenos podem alcançar o sangue diretamente dos tecidos ou por meio da linfa do ducto torácico.

Função Apresentadora de Antígenos das Células Dendríticas

Muitos estudos realizados in vitro e in vivo estabeleceram que a indução das respostas imunes primárias dependentes de células T a antígenos proteicos requer a presença de CD para capturar os antígenos e apresentá-los às células T. Isso foi demonstrado pela primeira vez para as respostas das células T CD4⁺; todavia, hoje, sabe-se que isso também se aplica às células T CD8⁺.

As CD possuem várias propriedades que fazem delas as APC mais eficientes para a iniciação de respostas de células T virgens.

As CD podem ingerir células infectadas e apresentar os antígenos dessas células aos linfócitos T CD8⁺. As CD são as melhores APC para induzir as respostas primárias das células T CD8⁺, porém isso representa um problema especial, visto que os antígenos reconhecidos por esses linfócitos podem ser produzidos por qualquer tipo de célula infectada por um vírus, não necessariamente CD. Algumas CD especializadas têm a capacidade de ingerir células infectadas por vírus ou fragmentos celulares e apresentar antígenos dessas células aos linfócitos T CD8⁺. Esse processo é denominado apresentação cruzada (cross-priming) e é descrito mais adiante, neste capítulo.

O MHC do Camundongo (Complexo H-2)

O MHC foi descoberto em estudos sobre transplante de tecidos, bem antes da elucidação da estrutura e função das moléculas do MHC. Sabia-se que os tecidos, como a pele, quando trocados entre animais não idênticos eram rejeitados, enquanto os mesmos enxertos entre gêmeos idênticos eram aceitos. Esse resultado mostrou que genes herdados deviam estar envolvidos no processo de rejeição dos tecidos. Na década de 1940, para analisar a base genética da rejeição de enxertos, George Snell e colegas produziram cepas de camundongos endogâmicos por meio de acasalamento repetido entre irmãos. Os camundongos endogâmicos são homozigotos para cada lócus genético (i. e., expressam apenas um alelo de cada gene, mesmo nos genes polimórficos), e cada camundongo de uma cepa endogâmica é geneticamente idêntico (singênico) a qualquer outro camundongo da mesma cepa (i. e., todos expressam os mesmos alelos). Diferentes cepas podem expressar alelos diferentes, e diz-se que são alogênicas entre si. Ao acasalar cepas congênitas de camundongos que rejeitavam enxertos de outras cepas, mas que eram idênticos para todos os outros genes, esses pesquisadores mostraram que uma única região genética é primariamente responsável pela rápida rejeição dos enxertos teciduais, e essa região foi denominada lócus principal de histocompatibilidade (histo, tecido). O lócus particular que foi identificado nos camundongos pelo grupo de Snell foi ligado a um gene no cromossomo 17, que codifica um antígeno de grupo sanguíneo, denominado antígeno II, razão pela qual essa região foi denominada histocompatibilidade-2 ou, simplesmente, H-2. Inicialmente, acreditou-se que esse lócus continha um único gene que controlava a compatibilidade tecidual. Entretanto, ocorreram eventos ocasionais de recombinação dentro do lócus H-2 durante o acasalamento de diferentes cepas, indicando que continha, na realidade, vários genes diferentes, porém estreitamente ligados, muitos dos quais estavam envolvidos na rejeição de enxertos. A região genética que controlava a rejeição de enxertos e continha vários genes ligados foi denominada complexo principal de histocompatibilidade. Embora não fosse conhecido na época dos experimentos de Snell, a rejeição de transplantes é, em grande parte, um processo mediado pelas células T (Cap. 16), e, por conseguinte, não é surpreendente que exista uma relação entre os genes do MHC, que codificam as moléculas do MHC de ligação de peptídeos que reconhecem as células T, e a rejeição aos enxertos.

O MHC Humano (HLA)

O MHC humano foi descoberto como resultado da procura de moléculas de superfície celular em um indivíduo, que seriam reconhecidas como estranhas por outro indivíduo. Essa tarefa tornou-se possível quando Jean Dausset, Jan van Rood e seus colegas descobriram que indivíduos que haviam recebido múltiplas transfusões de sangue e pacientes submetidos a transplantes renais apresentavam anticorpos que reconheciam células dos doadores de sangue ou de rim, enquanto mulheres multíparas produziam anticorpos circulantes que reconheciam as células paternas. As proteínas reconhecidas por esses anticorpos são denominadas antígenos leucocitários humanos (HLA) (leucocitário pelo fato de que os anticorpos foram testados pela sua ligação aos leucócitos de outros indivíduos, e antígenos pelo fato de as moléculas serem reconhecidas por anticorpos). Análises subsequentes mostraram que, como nos camundongos, a herança de alelos HLA particulares constitui um importante determinante da aceitação ou rejeição a um enxerto (Cap. 16). Os estudos bioquímicos realizados forneceram um resultado satisfatório, mostrando que as proteínas H-2 do camundongo e as proteínas HLA tinham estruturas essencialmente idênticas. Com base nesses resultados, chegou-se à conclusão de que os genes que determinam o destino dos tecidos enxertados estão presentes em todas as espécies de mamíferos e são homólogos aos genes H-2 identificados pela primeira vez em camundongos; são os denominados genes do MHC. Outros genes polimórficos que contribuem, em menor grau, para a rejeição de enxertos são denominados genes de histocompatibilidade menor; retornaremos a eles no Capítulo 16, quando iremos discutir a imunologia dos transplantes.

Genes da Resposta Imune

Durante quase 20 anos após a descoberta do MHC, seu único papel documentado era a rejeição de enxertos. Esse aspecto intrigava os imunologistas, visto que o transplante não é um fenômeno natural, e não havia motivos para que um conjunto de genes fosse preservado ao longo da evolução se a sua única função consistia em controlar a rejeição de enxertos de tecidos estranhos. Nas décadas de 1960 e 1970, foi descoberto que os genes do MHC são de suma importância para todas as respostas imunes a antígenos proteicos. Baruj Benacerraf, Hugh McDevitt e seus colegas verificaram que cepas endogâmicas de cobaias e camundongos diferiam na sua capacidade de produzir anticorpos contra alguns polipeptídeos sintéticos, sendo a responsividade herdada como traço mendeliano dominante. Os genes envolvidos foram denominados genes da resposta imune (Ir), e foi constatado que todos eram mapeados no MHC. Na atualidade, sabemos que os genes Ir são, de fato, os genes do MHC que codificam moléculas do MHC, que diferem na sua capacidade de ligação e apresentação de peptídeos derivados de vários antígenos proteicos. As cepas que respondem, isto é, as que podem desencadear respostas imunes a determinado antígeno polipeptídico, herdam alelos do MHC cujos produtos podem ligar-se a peptídeos derivados desses antígenos, formando complexos de peptídeo-MHC que podem ser reconhecidos pelas células T auxiliares. Em seguida, essas células T ajudam as células B a produzir anticorpos. As cepas que não respondem expressam moléculas do MHC que não são capazes de ligar-se a peptídeos derivados do antígeno polipeptídico, e, por conseguinte, essas cepas não podem gerar células T auxiliares nem anticorpos específicos contra o antígeno. Posteriormente, foi também constatado que muitas doenças autoimunes estão associadas à herança de determinados alelos do MHC, colocando definitivamente esses genes no centro dos mecanismos que controlam as respostas imunes. Esses estudos forneceram o estímulo para a realização de análises mais detalhadas dos genes e proteínas do MHC.

O Fenômeno de Restrição do MHC

A prova formal de que o MHC está envolvido no reconhecimento de antígenos pelas células T veio da demonstração experimental da restrição do MHC por Rolf Zinkernagel e Peter Doherty. Em seu estudo clássico, publicado em 1974, esses pesquisadores examinaram o reconhecimento de células infectadas por vírus por CTL específicos para determinados vírus em camundongos endogâmicos. Se houver infecção de um camundongo por um vírus, os CTL CD8⁺ específicos para o vírus desenvolvem-se no animal. Esses CTL reconhecem e matam as células infectadas pelo vírus apenas se as células infectadas expressarem alelos das moléculas do MHC que são reconhecidas no animal onde foram gerados os CTL (Fig. 6-6). Através do uso de cepas congênitas de MHC de camundongos (camundongos que eram idênticos em cada lócus genético, exceto o MHC), foi demonstrado que os CTL e a célula-alvo infectada devem derivar de camundongos que compartilham um alelo do MHC da classe I. Por conseguinte, o reconhecimento de antígenos específicos para CTL CD8⁺ é restrito aos alelos próprios do MHC da classe I. Experimentos subsequentes demonstraram que as respostas dos linfócitos T CD4⁺ auxiliares a antígenos são autorrestritas pelo MHC de classe II.

FIGURA 6-6 Demonstração experimental do fenômeno de restrição do MHC dos linfócitos T. Os linfócitos T citotóxicos (CTL) específicos de vírus, gerados em camundongos de cepa A infectados por vírus, matam apenas as células-alvo singênicas (cepa A) infectadas por aquele vírus. Os CTL não matam alvos de cepa A não infectados (que expressam peptídeos próprios, mas não peptídeos virais) ou alvos de cepa B infectados (que expressam diferentes alelos MHC em comparação com a cepa A). Com o uso de cepas congênitas de camundongos, que diferem apenas nos loci do MHC de classe I, foi provado que o reconhecimento do antígeno por CTL CD8⁺ é autorrestrito pelo MHC de classe I.

Continuaremos nossa discussão do MHC com a descrição das propriedades dos genes e suas proteínas, e concluiremos com a descrição de como essas proteínas ligam-se a antígenos estranhos e os apresentam.

Lócus do MHC Humano e de Camundongo

Nos seres humanos, o MHC localiza-se no braço curto do cromossomo 6 e ocupa um grande segmento de DNA, que se estende por cerca de 3.500 quilobases (kb). (Para comparação, um grande gene humano pode estender-se por até 50 a 100 kb, e o tamanho do genoma completo da bactéria Escherichia coli é de aproximadamente 4.500 kb.) Em termos genéticos clássicos, o lócus do MHC estende-se por cerca de 4 centimorgans, o que significa que ocorrem cruzamentos dentro do MHC com uma frequência de cerca de 4% a cada meiose. A Figura 6-8 mostra um mapa molecular do MHC humano.

FIGURA 6-8 Mapa do MHC humano. Os genes localizados dentro do lócus do MHC humano estão ilustrados. Além dos genes do MHC de classe I e classe II, os genes HLA-E, HLA-F e HLA-G e os genes MIC codificam moléculas semelhantes à classe I, muitas das quais são reconhecidas pelas células NK; os genes C4, C2 e do fator B codificam proteínas do complemento; tapasina, DM, DO, TAP e o proteassoma codificam proteínas envolvidas no processamento do antígeno; LTα, LTβ e TNF codificam citocinas. Muitos pseudogenes e genes, cujos papéis nas respostas imunes ainda não estão estabelecidos, estão localizados no complexo HLA, porém não estão ilustrados para simplificação do mapa.

Os genes HLA da classe I humanos foram definidos pela primeira vez por abordagens sorológicas (ligação de anticorpos). Existem três genes do MHC da classe I, denominados HLA-A, HLA-B e HLA-C, que codificam três moléculas do MHC da classe I com os mesmos nomes. Os genes do MHC da classe I foram identificados pela primeira vez com o uso de ensaios nos quais as células T de um indivíduo seriam ativadas por células de outro indivíduo (a denominada reação linfocitária mista; Cap. 16). Existem três loci de genes HLA da classe II, denominados HLA-DP, HLA-DQ e HLA-DR. Cada molécula do MHC de classe II é composta de um heterodímero de polipeptídeos α e β, e os loci DP, DQ e DR contêm, cada um deles, genes separados denominados A ou B, que codificam as cadeias α e β, respectivamente. Mais recentemente, foram utilizados métodos de sequenciamento do DNA para definir com mais precisão os genes do MHC e suas diferenças entre os indivíduos. A nomenclatura do lócus HLA leva em consideração o enorme polimorfismo (variação entre indivíduos) identificado por métodos sorológicos e moleculares. Por conseguinte, com base na moderna tipagem molecular, os alelos individuais podem ser denominados HLA-A*0201, referindo-se ao subtipo 01 do HLA-A2, ou HLA-DRB1*0401, referindo-se ao subtipo 01 do alelo DR4 no gene B1, e assim por diante.

O MHC do camundongo, localizado no cromossomo 17, ocupa cerca de 2.000 kb do DNA, e os genes estão organizados em uma sequência ligeiramente diferente do gene do MHC humano. Um dos genes da classe I do camundongo (H-2K) é centromérico para a região de classe II, porém os outros genes da classe I são teloméricos para a região de classe II. Existem três genes do MHC de classe I do camundongo, denominados H-2K, H-2D e H-2L, que codificam três proteínas diferentes do MHC da classe I: K, D e L. Esses genes são homólogos aos genes HLA-A, B e C humanos. Os alelos do MHC de determinadas cepas endogâmicas de camundongos são designados por letras em minúscula (p. ex., a, b), denominados para todo o conjunto de genes do MHC da cepa de camundongo onde foram identificados pela primeira vez. No linguajar característico de geneticistas de camundongos, o alelo do gene H-2K em uma cepa com o MHC tipo k é denominado K^k (pronunciado K de k), enquanto o alelo do gene H-2K em uma cepa com MHC do tipo d é denominado K^d (K de d). Emprega-se uma terminologia semelhante para os alelos H-2D e H-2L. Os camundongos apresentam dois loci do MHC de classe II denominados I-A e I-E, que codificam as moléculas I-A e I-E, respectivamente. Localizam-se nas sub-regiões A e E da região Ir do MHC, e foi constatado serem os genes Ir discutidos anteriormente. Os genes de classe II do camundongo são homólogos aos genes HLA-DP, DQ e DR humanos. O alelo I-A encontrado na cepa endogâmica de camundongo com os alelos K^k e D^k é denominado I-A^k (pronunciado I A de k). Uma terminologia semelhante é utilizada para o alelo I-E. Como nos seres humanos, existem, na realidade, dois genes diferentes, designados como A e B, nos loci I-A e I-E que codificam as cadeias α e β de cada molécula do MHC de classe II.

O conjunto de alelos do MHC presente em cada cromossomo é denominado haplótipo MHC. Por exemplo, um haplótipo HLA de um indivíduo pode ser HLA-A2, HLA-B5, HLA-DR3 e assim por diante. Naturalmente, todos os indivíduos heterozigotos possuem dois haplótipos HLA. Os camundongos endogâmicos, por serem homozigotos, apresentam um único haplótipo. Por conseguinte, o haplótipo de um camundongo H-2^d é H-2K^d I-A^d I-E^d D^d L^d.

Expressão das Moléculas do MHC

Como as moléculas do MHC são necessárias para apresentar antígenos aos linfócitos T, a expressão dessas proteínas em uma célula determina se antígenos estranhos (p. ex., microbianos) naquela célula serão reconhecidos pelas células T. Existem várias características importantes da expressão das moléculas do MHC que contribuem para o seu papel na proteção do indivíduo contra diversas infecções microbianas.

As moléculas de classe I são expressas de modo constitutivo em praticamente todas as células nucleadas, enquanto as moléculas de classe II são expressas apenas nas células dendríticas, nos linfócitos B, nos macrófagos e em alguns outros tipos celulares. Esse padrão de expressão do MHC está ligado às funções das células T restritas à classe I e à classe II. A função efetora dos CTL CD8⁺ restritos à classe I consiste em eliminar as células infectadas por micro-organismos intracelulares, como os vírus, bem como tumores que expressam antígenos tumorais. A expressão das moléculas do MHC de classe I nas células nucleadas proporciona um sistema de apresentação para antígenos virais e tumorais. Por sua vez, os linfócitos T CD4⁺ auxiliares restritos à classe II desempenham um conjunto de funções que exigem o reconhecimento do antígeno apresentado por um número mais limitado de tipos celulares. Em particular, as células T CD4⁺ virgens precisam reconhecer antígenos que são capturados e apresentados pelas células dendríticas nos órgãos linfoides. Os linfócitos T CD4⁺ auxiliares diferenciados funcionam principalmente para ativar (ou auxiliar) os macrófagos a eliminar os micro-organismos extracelulares que foram fagocitados e para ativar os linfócitos B a produzir anticorpos que também eliminam micro-organismos extracelulares. As moléculas de classe II são expressas principalmente nesses tipos celulares e proporcionam um sistema de apresentação de peptídeos derivados de micro-organismos e proteínas extracelulares.

A expressão das moléculas do MHC é aumentada pelas citocinas produzidas durante as respostas imunes tanto inatas quanto adaptativas (Fig. 6-9). Na maioria dos tipos celulares, os interferons IFN-α, IFN-β e IFN-γ aumentam o nível de expressão das moléculas de classe I. Os interferons são citocinas produzidas durante a fase inicial da resposta imune inata a numerosos vírus (Cap. 4). Por conseguinte, as respostas imunes inatas a vírus aumentam a expressão das moléculas do MHC que apresentam antígenos virais às células T específicas para vírus. Este é um dos mecanismos pelos quais a imunidade inata estimula respostas imunes adaptativas.

FIGURA 6-9 Aumento da expressão do MHC de classe II pelo IFN-γ. O IFN-γ, que é produzido por células NK e por outros tipos celulares durante as reações imunes inatas a micro-organismos ou por células T durante reações imunes adaptativas, estimula a expressão do MHC de classe II nas APC, aumentando, assim, a ativação das células T CD4⁺. O IFN-γ e os interferons tipo I exercem um efeito semelhante sobre a expressão das moléculas do MHC de classe I e a ativação das células T CD8⁺.

A expressão das moléculas de classe II também é regulada por citocinas e por outros sinais em diferentes células. O IFN-γ é a principal citocina envolvida na estimulação da expressão das moléculas de classe II nas APC, como células dendríticas e macrófagos (Fig. 6-9). O IFN-γ pode ser produzido pelas células NK durante as reações imunes inatas e por células T ativadas por antígenos durante reações imunes adaptativas. A capacidade do IFN-γ de aumentar precocemente a expressão do MHC da classe II sobre as APC constitui um mecanismo de amplificação da imunidade adaptativa. Conforme assinalado anteriormente, a expressão das moléculas da classe II também aumenta em resposta a sinais dos receptores semelhantes a Toll que respondem a componentes microbianos, promovendo, assim, a apresentação de antígenos microbianos. Os linfócitos B expressam constitutivamente moléculas de classe II e podem aumentar a sua expressão em resposta ao reconhecimento de antígenos e citocinas produzidos pelas células T auxiliares, intensificando, assim, a apresentação de antígenos às células auxiliares (Cap. 11). O IFN-γ também aumenta a expressão das moléculas do MHC nas células endoteliais vasculares e em outros tipos celulares não imunes; o papel dessas células na apresentação do antígeno aos linfócitos T não está bem esclarecido. Algumas células, como os neurônios, nunca parecem expressar moléculas de classe II. As células T humanas ativadas, mas não as de camundongos, expressam moléculas de classe II após a sua ativação; entretanto, ainda não foi identificada nenhuma citocina envolvida nessa resposta, e o seu significado funcional é desconhecido.

A taxa de transcrição constitui o principal determinante do nível de síntese e expressão de moléculas do MHC na superfície celular. As citocinas intensificam a expressão do MHC ao estimular a transcrição dos genes de classes I e II em uma ampla variedade de tipos celulares. Esses efeitos são mediados pela ligação de fatores de transcrição ativados por citocinas a sequências do DNA nas regiões promotoras dos genes do MHC. Vários fatores de transcrição podem ser montados, e esses fatores ligam-se a uma proteína denominada ativador da transcrição de classe II (CIITA), e todo o complexo liga-se ao promotor de classe II e promove uma transcrição eficiente. Ao manter o complexo de fatores de transcrição unido, o CIITA atua como um regulador mestre da expressão dos genes de classe II. O CIITA é sintetizado em resposta ao IFN-γ, o que explica como essa citocina aumenta a expressão das moléculas do MHC da classe II. Foram identificadas mutações em vários desses fatores de transcrição como causa de doenças por imunodeficiência humana associadas à expressão deficiente das moléculas do MHC. Dentre elas, a doença mais bem estudada é a síndrome do linfócito nu (Cap. 20). Os camundongos knockout que carecem do CIITA também exibem uma redução ou ausência de expressão da classe II nas células dendríticas e nos linfócitos B e uma incapacidade do IFN-γ de induzir a classe II em todos os tipos celulares.

A expressão de muitas das proteínas envolvidas no processamento e na apresentação de antígenos é regulada de modo coordenado. Por exemplo, o IFN-γ aumenta a transcrição não apenas dos genes das classes I e II, mas também de vários genes cujos produtos são necessários para a montagem do MHC de classe I e a apresentação de peptídeos, como genes que codificam o transportador TAP e algumas das subunidades de proteassomas, conforme discutido adiante neste capítulo.

Propriedades Gerais das Moléculas do MHC

Todas as moléculas do MHC compartilham certas características estruturais, que são críticas para a sua função na apresentação de peptídeos e no reconhecimento de antígenos pelos linfócitos.

Moléculas do MHC de Classe I

As moléculas de classe I consistem em duas cadeias polipeptídicas ligadas de modo não covalente: uma cadeia α de 44 a 47 kD codificada pelos loci MHC (ou cadeia pesada) e uma subunidade de 12 kD não codificada pelos loci MHC, denominada β₂-microglobulina (Fig. 6-10). Cada cadeia α está orientada de tal modo que cerca de três quartos do polipeptídeo completo estendem-se no meio extracelular, um pequeno segmento hidrofóbico atravessa a membrana celular, e os resíduos carboxil-terminais estão localizados no citoplasma. Os segmentos α1 e α2 aminoterminais (N-terminais) da cadeia α, constituídos, cada um, de aproximadamente 90 resíduos de comprimento, interagem para formar uma plataforma de lâmina β-pregueada antiparalela contendo oito fitas que sustentam duas fitas paralelas de hélice α. Isso forma a fenda de ligação de peptídeos das moléculas de classe I. Seu tamanho é grande o suficiente (∼25 Å × 10 Å × 11 Å) para ligar peptídeos de 8 a 11 aminoácidos em uma conformação estendida e flexível. As extremidades da fenda de ligação de peptídeos das moléculas de classe I são fechadas, de modo que não pode haver acomodação de peptídeos maiores. Por conseguinte, as proteínas globulares nativas precisam ser “processadas” para gerar fragmentos pequenos o suficiente para ligar-se às moléculas do MHC e serem reconhecidas pelas células T (descritas mais adiante). Os resíduos polimórficos das moléculas de classe I estão confinados aos domínios α1 e α2, onde contribuem para as variações entre diferentes alelos de classe I na ligação de peptídeos e no reconhecimento pelas células T (Fig. 6-11). O segmento α3 da cadeia α se dobra para formar um domínio de Ig, cuja sequência de aminoácidos é conservada em todas as moléculas de classe I. Esse segmento contém o sítio de ligação para a molécula CD8. Na extremidade carboxil-terminal do segmento α3, existe uma extensão de aproximadamente 25 aminoácidos hidrofóbicos, que atravessam a dupla camada lipídica da membrana plasmática. Imediatamente depois, são encontrados cerca de 30 resíduos localizados no citoplasma, que incluem um agrupamento de aminoácidos básicos que interagem com grupos de extremidade de fosfolipídeos do folheto interno da dupla camada lipídica e que ancoram a molécula do MHC na membrana plasmática.

FIGURA 6-10 Estrutura de uma molécula do MHC de classe I. O diagrama esquemático (à esquerda) ilustra as diferentes regiões da molécula do MHC (não desenhado na escala). As moléculas de classe I são compostas de uma cadeia α polimórfica ligada de modo não covalente à β₂-microglobulina (β₂m) não polimórfica. A cadeia α é glicosilada; os resíduos de carboidratos não são mostrados. O diagrama em formato de fita (à direita) mostra a estrutura da porção extracelular da molécula HLA-B27 ligada a um peptídeo, conforme demonstrado por cristalografia por raios X.

(Cortesia de Dr. P. Bjorkman, California Institute of Technology, Pasadena.)

FIGURA 6-11 Resíduos polimórficos das moléculas do MHC. Os resíduos polimórficos das moléculas do MHC de classes I e II estão localizados nas fendas de ligação de peptídeos e nas hélices α ao redor das fendas. As regiões de maior variabilidade entre diferentes alelos HLA estão indicadas em vermelho, as de variabilidade intermediária, em verde, e as de menor variabilidade, em azul.

(Reproduzido com permissão de Margulies DH, K Natarajan, J Rossjohn e J McCluskey. Major histocompatibility complex [MH] molecules: structure, function, and genetics. In WE Paul [ed]: Fundamental Immunology, 6th ed. Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, 2008.)

A β₂-microglobulina, a cadeia leve das moléculas de classe I, é codificada por um gene fora dos loci MHC e seu nome deriva de sua mobilidade eletroforética (β₂), tamanho (micro) e solubilidade (globulina). A β₂-microglobulina interage de modo não covalente com o domínio α3 da cadeia α. À semelhança do segmento α3, a β₂-microglobulina é estruturalmente homóloga a um domínio de Ig e é constante entre todas as moléculas de classe I.

A molécula de classe I totalmente montada é um heterotrímero, que consiste em uma cadeia α, β₂-microglobulina e um peptídeo antigênico ligado; a expressão estável das moléculas de classe I na superfície celular exige a presença de todos os três componentes do heterotrímero. A razão disso é que a interação da cadeia α com a β₂-microglobulina é estabilizada pela ligação de antígenos peptídicos à fenda formada pelos segmentos α1 e α2; por sua vez, a ligação do peptídeo é fortalecida pela interação da β₂-microglobulina com a cadeia α. Como os peptídeos antigênicos são necessários para estabilizar as moléculas do MHC, apenas as moléculas do MHC carregadas de peptídeos potencialmente úteis são expressas na superfície celular.

Os indivíduos são, em sua maioria, heterozigotos para os genes do MHC e, portanto, expressam seis moléculas diferentes de classe I em cada célula, contendo cadeias α codificadas pelos dois alelos herdados (pai e mãe) dos genes HLA-A, HLA-B e HLA-C.

Moléculas do MHC de Classe II

As moléculas do MHC de classe II são compostas de duas cadeias polipeptídicas associadas de forma não covalente, uma cadeia α de 32 a 34 kD e uma cadeia β de 29 a 32 kD (Fig. 6-12). Diferentemente das moléculas de classe I, os genes que codificam ambas as cadeias das moléculas de classe II são polimórficos e estão presentes no lócus do MHC II.

FIGURA 6-12 Estrutura de uma molécula do MHC de classe II. O diagrama esquemático (à esquerda) ilustra as diferentes regiões da molécula do MHC (não desenhada em escala). As moléculas de classe II são compostas de uma cadeia α polimórfica ligada de modo não covalente a uma cadeia β polimórfica. Ambas as cadeias são glicosiladas; os resíduos de carboidratos não estão representados. O diagrama em forma de fita (à direita) mostra a estrutura da porção extracelular da molécula HLA-DR1 com um peptídeo ligado, conforme demonstrado por cristalografia por raio X.

(Cortesia de Dr. P. Bjorkman, California Institute of Technology, Pasadena.)

Os segmentos α1 e β1 aminoterminais das cadeias de classe II interagem para formar a fenda de ligação de peptídeos, que é estruturalmente semelhante à fenda das moléculas de classe I. Quatro fitas no assoalho da fenda e uma fita das paredes α-helicoidais são formadas pelo segmento α1, enquanto as outras quatro fitas do assoalho e da segunda parede são formadas pelo segmento β1. Os resíduos polimórficos estão localizados nos segmentos α1 e β1, dentro e ao redor da fenda de ligação de peptídeos, como nas moléculas de classe I (Fig. 6-11). Nas moléculas de classe II dos seres humanos, a maior parte do polimorfismo está na cadeia β. Nas moléculas de classe II, as extremidades da fenda de ligação de peptídeos estão abertas, permitindo a ligação de peptídeos de 30 ou mais resíduos.

Os segmentos α2 e β2 das moléculas de classe II, à semelhança do segmento α3 e da β₂-microglobulina de classe I, enovelam-se em domínios de Ig e não são polimórficos, isto é, não variam entre alelos de um determinado gene de classe II. O segmento β2 das moléculas de classe II contém o sítio de ligação de CD4, semelhante ao sítio de ligação de CD8 no segmento α3 da cadeia pesada de classe I. Em geral, as cadeias α de um lócus do MHC de classe II (p. ex., DR) emparelham-se mais frequentemente com cadeias β do mesmo lócus e, menos comumente, com cadeias β de outros loci (p. ex., DQ, DP). As extremidades carboxil-terminais dos segmentos α2 e β2 continuam-se em regiões de conexão curta, seguidas de extensões de aproximadamente 25 aminoácidos de resíduos transmembrana hidrofóbicos. Em ambas as cadeias, as regiões transmembrana terminam em grupos de resíduos de aminoácidos básicos, seguidos de caudas citoplasmáticas hidrofílicas curtas.

A molécula de classe II totalmente montada é um heterotrímero que consiste em uma cadeia α, uma cadeia β e um peptídeo antigênico ligado; a expressão estável das moléculas de classe II na superfície celular requer a presença de todos os três componentes do heterotrímero. À semelhança das moléculas de classe I, isso assegura que as moléculas do MHC que terminam na superfície celular sejam aquelas que estão desempenhando a função normal de apresentação de peptídeos.

Os seres humanos herdam de cada um dos pais um gene DPA1 e um gene DPB1, que codificam, respectivamente, as cadeias α e β de uma molécula de HLA-DP; um gene DQA1 e um gene DQB1; e um gene DRA1, um gene DRB1 e um gene DRB duplicado separado, que pode codificar os alelos DRB3, 4 ou 5. Por conseguinte, cada indivíduo heterozigoto herda seis ou oito alelos do MHC de classe II, três ou quatro de cada progenitor (um conjunto de cada de DP e DQ, e um ou dois de DR). Tipicamente, não há muita recombinação entre genes de loci diferentes (i. e., DRα com DQβ, e assim por diante), e cada haplótipo tende a ser herdado como uma unidade isolada. Entretanto, como alguns haplótipos contêm loci DRB extras que produzem cadeias β que são montadas com DRα, e algumas moléculas DQα codificadas em um cromossomo podem associar-se a moléculas DQβ produzidas do outro cromossomo, o número total de moléculas de classe II expressas pode ser consideravelmente maior que seis.

Características das Interações Peptídeo-MHC

As moléculas do MHC exibem ampla especificidade para a ligação de peptídeos, em contraste com a especificidade fina do reconhecimento de antígenos pelos receptores de antígenos dos linfócitos. Existem várias características importantes nas interações entre moléculas do MHC e peptídeos antigênicos.

Base Estrutural da Ligação de Peptídeos às Moléculas do MHC

A ligação de peptídeos às moléculas do MHC é uma interação não covalente mediada por resíduos tanto nos peptídeos quanto nas fendas das moléculas do MHC. Como veremos adiante, os antígenos proteicos são clivados proteoliticamente nas APC, gerando os peptídeos que serão ligados e apresentados pelas moléculas do MHC. Esses peptídeos ligam-se às fendas das moléculas do MHC em uma conformação estendida. Uma vez ligados, os peptídeos e suas moléculas de água associadas ocupam as fendas, estabelecendo contatos extensos com os resíduos de aminoácidos que formam as fitas β-pregueadas do assoalho e as hélices α das paredes da fenda (Fig. 6-13). No caso das moléculas do MHC de classe I, a associação de um peptídeo ao sulco do MHC depende da ligação da extremidade N-terminal de carga positiva e da extremidade C-terminal de carga negativa do peptídeo à molécula do MHC por interações eletrostáticas. Na maioria das moléculas do MHC, as fitas β do assoalho da fenda contêm “bolsas”. Muitas moléculas de classe I possuem uma bolsa hidrofóbica, que reconhece um dos seguintes aminoácidos hidrofóbicos — valina, isoleucina, leucina ou metionina — na extremidade C-terminal do peptídeo. Algumas moléculas de classe I têm predileção por um resíduo básico (lisina ou arginina) na extremidade C-terminal. Além disso, outros resíduos de aminoácidos de um peptídeo podem conter cadeias laterais que se encaixam em bolsas específicas e ligam-se a aminoácidos complementares na molécula do MHC através de interações eletrostáticas (pontes de sal com carga), ligação de hidrogênio ou interações de van der Waals. Esses resíduos do peptídeo são denominados resíduos âncora, visto que contribuem principalmente com a maior parte das interações favoráveis da ligação (i. e., eles ancoram o peptídeo na fenda da molécula do MHC). Cada peptídeo ligado ao MHC habitualmente contém apenas um ou dois resíduos de âncora, e isso presumivelmente permite uma maior variabilidade nos outros resíduos do peptídeo, que são os resíduos reconhecidos por células T específicas. No caso de alguns peptídeos que se ligam às moléculas do MHC, particularmente moléculas de classe II, as interações específicas dos peptídeos com os lados helicoidais α da fenda do MHC também contribuem para a ligação do peptídeo através da formação de pontes de hidrogênio ou interações com cargas. As moléculas do MHC de classe II acomodam peptídeos maiores do que as moléculas de classe I. Esses peptídeos mais longos estendem-se em ambas as extremidades além do assoalho do sulco.

FIGURA 6-13 Ligação de peptídeo às moléculas do MHC. A, Essas duas vistas superiores da estrutura cristalina das moléculas do MHC mostram como os peptídeos ficam localizados nas fendas de ligação de peptídeos. A molécula de classe I mostrada é a HLA-A2, e a molécula de classe II é a HLA-DR1. A fenda da molécula de classe I está fechada, enquanto a da molécula da classe II está aberta. Em consequência, as moléculas de classe II acomodam peptídeos mais longos do que as moléculas de classe I. B, A vista lateral de um corte de um peptídeo ligado a uma molécula do MHC de classe II mostra como os resíduos do peptídeo servem de âncora para prendê-lo nas bolsas da fenda da molécula do MHC.

A, (Reimpresso com permissão de Macmillian Publishers Ltd. de Bjorkman PJ, MA Saper, B Samraoui, WS Bennett, JL Strominger, e DC Wiley. Structure of the human class I histocompatibility antigen HLA-A2. Nature 329:506-512, 1987; e Brown J, TS Jardetzky, JC Gorga, LJ Stern, RG Urban, JL Strominger, e DC Wiley. Three-dimensional structure of the human class II histocompatibility antigen HLA-DR1. Nature 364:33-39, 1993.) B, (De Scott CA, PA Peterson, L Teyton, e IA Wilson. Crystal structures of two I-Ad-peptide complexes reveal that high affinity can be achieved without large anchor residues. Immunity 8:319-329, 1998. Copyright 1998, com autorização de Elsevier Science.)

Como muitos dos resíduos dentro e ao redor da fenda de ligação de peptídeos das moléculas do MHC são polimórficos (i. e., diferem entre vários alelos do MHC), diferentes alelos favorecem a ligação de diferentes peptídeos. Esta é a base estrutural da função dos genes do MHC como “genes da resposta imune”; somente os animais que expressam alelos do MHC capazes de ligar-se a determinado peptídeo e apresentá-lo às células T podem responder àquele peptídeo.

Os receptores de antígenos das células T reconhecem tanto o peptídeo antigênico quanto as moléculas do MHC, sendo o peptídeo responsável pela especificidade fina do reconhecimento do antígeno, enquanto os resíduos do MHC são responsáveis pela restrição das células T ao MHC. Uma parte do peptídeo ligado é exposta na parte superior aberta da fenda da molécula do MHC, e as cadeias laterais de aminoácidos dessa porção do peptídeo são reconhecidas pelos receptores de antígenos de células T específicas. O mesmo receptor de células T também interage com resíduos polimórficos das hélices α da própria molécula do MHC (Fig. 6-1). Previsivelmente, as variações no antígeno peptídico ou na fenda de ligação de peptídeos da molécula do MHC alterarão a apresentação daquele peptídeo ou o seu reconhecimento pelas células T. Com efeito, pode-se aumentar a imunogenicidade de um peptídeo ao incorporar um resíduo que fortalece a ligação do antígeno às moléculas do MHC comumente herdadas em uma população.

Como as moléculas do MHC podem ligar apenas peptídeos, e a maioria dos antígenos consiste em grandes proteínas, devem existir maneiras pelas quais essas proteínas são convertidas em peptídeos. Essa conversão, que é denominada processamento do antígeno, constitui o foco do restante deste capítulo.

Fontes de Antígenos Proteicos Citosólicos

Os antígenos proteicos citosólicos são sintetizados, em sua maioria, dentro das células, e alguns deles são fagocitados e transportados para o citosol. Os antígenos estranhos no citosol podem ser produtos de vírus ou de outros micro-organismos intracelulares que infectam essas células. Nas células tumorais, vários genes que sofreram mutação ou hiperexpressão podem produzir antígenos proteicos que são reconhecidos por CTL restritos à classe I (Cap. 17). Os peptídeos que são apresentados em associação a moléculas de classe I também podem derivar de micro-organismos e outros antígenos particulados que são internalizados em fagossomos, mas que escapam para o citosol. Alguns micro-organismos são capazes de lesionar as membranas dos fagossomos e criar poros através dos quais eles e seus antígenos escapam para o citosol. Por exemplo, as cepas patogênicas de Listeria monocytogenes produzem uma proteína, denominada listeriolisina, que permite o escape das bactérias das vesículas para o citosol. (Esse escape constitui um mecanismo que as bactérias podem ter desenvolvido para resistir à destruição pelos mecanismos microbicidas dos fagócitos, cuja maior parte está concentrada em fagolisossomos.) Uma vez no citosol, os antígenos dos micro-organismos fagocitados são processados como outros antígenos citosólicos. Nas células dendríticas, alguns antígenos que são ingeridos dentro de vesículas entram na via da classe I citosólica, no processo denominado apresentação cruzada, que é descrita mais adiante. Outras fontes importantes de peptídeos no citosol são proteínas enoveladas incorretamente no RE, que são translocadas para o citosol e degradadas como outras proteínas citosólicas; esse processo é denominado degradação associado ao RE.

Digestão Proteolítica de Proteínas Citosólicas

O principal mecanismo para a geração de peptídeos de antígenos proteicos citosólicos consiste em proteólise pelo proteassoma. Os proteassomas são grandes complexos enzimáticos multiproteicos, com ampla variedade de atividade proteolítica, que são encontrados no citoplasma e nos núcleos da maioria das células. O proteassoma aparece como um cilindro composto de uma série empilhada de dois anéis β internos e dois anéis α externos, sendo cada anel constituído de sete subunidades, com uma estrutura semelhante a um capuz em ambas as extremidades do cilindro. As proteínas nos anéis α externos são estruturais e carecem de atividade proteolítica; nos anéis β internos, três das sete subunidades (β1, β2 e β5) constituem os sítios catalíticos para proteólise.

O proteassoma desempenha uma função de manutenção básica nas células através da degradação de numerosas proteínas danificadas ou inadequadamente enoveladas. A síntese proteica ocorre normalmente em uma velocidade rápida, com incorporação de cerca de seis a oito resíduos de aminoácidos a cada segundo no processo de alongamento das cadeias. O processo está sujeito a erro, e estima-se que cerca de 20% das proteínas recém-sintetizadas não estejam adequadamente enoveladas. Esses produtos ribossômicos defeituosos, bem como proteínas inúteis mais velhas, constituem alvos de degradação proteassômica através da ligação covalente de várias cópias de um pequeno polipeptídeo, denominado ubiquitina. As proteínas ubiquitinadas, com cadeias de quatro ou mais ubiquitinas, são reconhecidas pelo capuz do proteassoma e, em seguida, desdobradas, a ubiquitina é removida, e as proteínas são “estendidas em fio” através dos proteassomas, onde são degradadas em peptídeos. O proteassoma possui ampla especificidade de substrato e pode gerar uma ampla variedade de peptídeos das proteínas citosólicas (todavia, em geral, ele não degrada as proteínas totalmente em aminoácidos). É interessante assinalar que, em células tratadas com a citocina IFN-γ, ocorre aumento na transcrição e síntese de três novas subunidades catalíticas do proteassoma, conhecidas como β1i, β2i e β5i, que substituem as três subunidades catalíticas do anel β do proteassoma. Isso resulta em uma mudança de especificidade de substrato do proteassoma, de modo que os peptídeos produzidos contêm habitualmente aminoácidos hidrofóbicos carboxil-terminais, como leucina, valina, isoleucina e metionina, ou resíduos básicos, como lisina ou arginina. Esses tipos de extremidades C-terminais são típicos de peptídeos que são transportados na via de classe I e que se ligam a moléculas de classe I. Trata-se de um mecanismo pelo qual IFN-γ aumenta a apresentação de antígenos, enquanto outro mecanismo consiste no aumento na expressão de moléculas do MHC (Fig. 6-9). Por conseguinte, os proteassomas são excelentes exemplos de organelas cuja função celular básica foi adaptada para um papel especializado na apresentação de antígenos.

Alguns antígenos proteicos aparentemente não necessitam de ubiquitinação nem de proteassomas para a sua apresentação pela via do MHC de classe I e, presumivelmente, são degradados por proteases citosólicas. Além disso, as sequências de sinais das proteínas direcionadas para a membrana e proteínas destinadas a serem secretadas são habitualmente clivadas por peptidase de sinal e degradadas proteoliticamente logo após a sua síntese e translocação para o RE. Esse processamento do RE gera peptídeos de ligação de classe I sem a necessidade de proteólise no citosol.

Transporte de Peptídeos do Citosol para o Retículo Endoplasmático

Os peptídeos gerados no citosol são translocados por um transportador especializado para o RE, onde moléculas do MHC de classe I recém-sintetizadas estão disponíveis para a ligação dos peptídeos. Como os peptídeos antigênicos destinados a se ligarem às moléculas da classe I são gerados no citosol mas as moléculas do MHC de classe I são sintetizadas no RE, é necessário um mecanismo para o transporte dos peptídeos citosólicos para dentro do RE. Esse transporte é mediado por uma proteína dimérica, denominada transportador associado ao processamento de antígeno (TAP), que é homóloga à família do transportador ABC de proteínas que medeiam o transporte de compostos de baixo peso molecular dependente de ATP através das membranas celulares. A proteína TAP localiza-se na membrana do RE, onde medeia o transporte ativo dependente de ATP de peptídeos do citosol para dentro da luz do RE. Embora o heterodímero de TAP tenha uma ampla gama de especificidades, ele transporta melhor peptídeos cujo comprimento varia de 8 a 16 aminoácidos e que contêm extremidades carboxil-terminais básicas (nos seres humanos) ou hidrofóbicas (nos seres humanos e em camundongos). Conforme assinalado anteriormente, trata-se das características dos peptídeos que são gerados no proteassoma e são capazes de ligar-se às moléculas do MHC de classe I.

No lado luminal da membrana do RE, a proteína TAP associa-se a uma proteína denominada tapasina, que também possui afinidade por moléculas do MHC de classe I recém-sintetizadas e não ocupadas (com as fendas vazias). Por conseguinte, a tapasina faz com que o transportador TAP forme um complexo com as moléculas do MHC de classe I que estão aguardando a chegada de peptídeos.

Montagem dos Complexos Peptídeo-MHC de Classe I no Retículo Endoplasmático

Os peptídeos translocados para dentro do RE ligam-se a moléculas do MHC de classe I que estão associadas ao dímero TAP através da tapasina. A síntese e a montagem das células de classe I envolvem um processo de múltiplas etapas, em que a ligação do peptídeo desempenha um papel-chave. As cadeias α de classe I e a β₂-microglobulina são sintetizadas no RE. O enovelamento apropriado das cadeias α nascentes é auxiliado por proteínas chaperonas, como a chaperona de membrana calnexina e a chaperona luminal calreticulina. No interior do RE, os dímeros de classe I recém-formados e não ocupados permanecem ligados ao complexo TAP. As moléculas do MHC de classe I não ocupadas, a tapasina e o TAP fazem parte de um complexo maior de carregamento de peptídeo no RE, que também inclui a calnexina, a calreticulina e a oxidorredutase Erp57, todas as quais contribuem para a montagem e o carregamento das moléculas de classe I. Os peptídeos que entram no RE através do TAP e aqueles produzidos no RE, como peptídeos de sinal, frequentemente são reduzidos ao tamanho apropriado para ligação ao MHC pela aminopeptidase residente no RE, PARE. O peptídeo é então capaz de se ligar à fenda da molécula de classe I adjacente. Uma vez carregadas com o peptídeo, as moléculas do MHC de classe I deixam de ter afinidade pela tapasina, de modo que o complexo peptídeo-classe I é liberado da tapasina e pode sair do RE e ser transportado até a superfície da célula. Na ausência de peptídeo ligado, muitos dos dímeros de cadeia α-β₂ microglobulina recém-formados são instáveis e não podem ser transportados eficientemente do RE para o Golgi. Esses complexos do MHC de classe I não ocupados e inadequadamente enovelados são transportados para o citosol e degradados em proteassomas.

Os peptídeos transportados para dentro do RE ligam-se preferencialmente a moléculas do MHC de classe I, mas não de classe II, por dois motivos. Em primeiro lugar, as moléculas de classe I recém-sintetizadas estão fixadas na face luminal do complexo TAP e capturam peptídeos rapidamente, à medida que estes são transportados para dentro do RE pelo TAP. Em segundo lugar, conforme discutido adiante, no RE, as fendas de ligação de peptídeos das moléculas de classe II recém-sintetizadas são bloqueadas pela I_i associada.

Expressão dos Complexos Peptídeo-MHC de Classe I na Superfície

As moléculas do MHC de classe I com peptídeos ligados são estruturalmente estáveis e são expressas na superfície celular. Os complexos de peptídeo-MHC de classe I estáveis que foram produzidos no RE movem-se através do complexo de Golgi e são transportados até a superfície da célula por vesículas exocíticas. Uma vez expressos na superfície celular, os complexos de peptídeo-classe I podem ser reconhecidos por células T CD8⁺ específicas de antígenos peptídicos, enquanto o correceptor CD8 desempenha um papel essencial através de sua ligação a regiões não polimórficas da molécula de classe I. Em capítulos posteriores, voltaremos a discutir o papel dos CTL restritos à classe I na imunidade protetora. Diversos vírus desenvolveram mecanismos que interferem na montagem e acoplamento de peptídeos às moléculas de classe I, ressaltando a importância dessa via na imunidade antiviral (Cap. 15).

Geração de Proteínas Vesiculares

Os peptídeos associados à classe II derivam, em sua maioria, de antígenos proteicos que são capturados do meio extracelular e internalizados em endossomos por APC especializadas. As etapas iniciais na apresentação de um antígeno proteico extracelular consistem na ligação do antígeno nativo a uma APC e na sua internalização. Diferentes APC podem ligar-se a antígenos proteicos de diversas maneiras e com eficiência e especificidade variáveis. As células dendríticas e os macrófagos expressam uma variedade de receptores de superfície, que reconhecem estruturas compartilhadas por numerosos micro-organismos (Cap. 4). Essas APC utilizam os receptores para ligar e internalizar eficientemente os micro-organismos. Os macrófagos também expressam receptores para as porções Fc dos anticorpos, bem como receptores para a proteína do complemento C3b, que se ligam a antígenos com anticorpos ou proteínas do complemento fixados e intensificam a sua internalização. Outro exemplo de receptores específicos nas APC é a imunoglobulina de superfície nas células B, que, em virtude de sua alta afinidade por antígenos, é capaz de mediar efetivamente a internalização de proteínas presentes em concentrações muito baixas no líquido extracelular (Cap. 11).

Após a sua internalização, os antígenos proteicos passam a se localizar dentro de vesículas intracelulares delimitadas por membrana, denominadas endossomos. A via endossômica de trânsito das proteínas intracelulares comunica-se com lisossomos, que consistem em vesículas mais densas delimitadas por membrana e contendo enzimas. Um subgrupo de endossomos tardios ricos em MHC de classe II desempenha um papel especial no processamento e na apresentação do antígeno pela via da classe II, que será descrito posteriormente. Os micro-organismos particulados são internalizados em vesículas denominadas fagossomos, que podem se fundir com os lisossomos, produzindo vesículas denominadas fagolisossomos ou lisossomos secundários. Alguns micro-organismos, como micobactérias e Leishmania, podem sobreviver e até mesmo sofrer replicação dentro dos fagossomos ou endossomos, proporcionando uma fonte persistente de antígenos em compartimentos vesiculares.

Outras proteínas além daquelas ingeridas do meio extracelular também podem entrar na via do MHC de classe II. Algumas moléculas de proteína destinadas à secreção podem entrar nas mesmas vesículas que as moléculas do MHC de classe II e podem ser processadas, em lugar de serem secretadas. Com menos frequência, proteínas citoplasmáticas e da membrana podem ser processadas e apresentadas por moléculas de classe II. Em alguns casos, isso pode resultar da digestão enzimática do conteúdo citoplasmático, designada como autofagia. Nessa via, as proteínas citoplasmáticas são capturadas dentro de vesículas delimitadas por membrana, denominadas autofagossomos; essas vesículas fundem-se com os lisossomos, e as proteínas citoplasmáticas são proteoliticamente degradadas. Os peptídeos produzidos por essa via podem ser transportados até o mesmo compartimento vesicular de classe II do que os peptídeos derivados de antígenos ingeridos. A autofagia é basicamente um mecanismo para degradação das proteínas celulares e a reciclagem de seus produtos como fontes de nutrientes durante épocas de estresse. Participa também na destruição dos micro-organismos intracelulares, que estão encerrados em vesículas e que são transportados até os lisossomos. Por conseguinte, é previsível que os peptídeos gerados por autofagia sejam apresentados para reconhecimento das células T. Alguns peptídeos que estão associados a moléculas de classe II derivam de proteínas da membrana, que podem ser recicladas na mesma via endocítica das proteínas extracelulares. Por conseguinte, até mesmos os vírus, que se replicam no citoplasma das células infectadas, podem produzir proteínas que são degradadas em peptídeos que entram na via do MHC de classe II de apresentação de antígenos. Isso pode constituir um mecanismo para a ativação das células T auxiliares CD4⁺ específicas de antígenos virais.

Digestão Proteolítica das Proteínas em Vesículas

As proteínas internalizadas sofrem degradação enzimática nos endossomos tardios e lisossomos, gerando peptídeos que também são capazes de ligar-se às fendas de ligação de peptídeos das moléculas do MHC de classe II. A degradação dos antígenos proteicos em vesículas é um processo ativo mediado por proteases que possuem pH ácido ótimo. As proteases mais abundantes dos endossomos tardios são catepsinas, que são tiol e aspartil proteases com ampla especificidade de substrato. Várias catepsinas contribuem para a geração de peptídeos para a via da classe II. As proteínas parcialmente degradadas ou clivadas ligam-se às fendas de extremidades abertas das moléculas de MHC de classe II e, em seguida, são reduzidas enzimaticamente a seu tamanho final. Os estudos de imunomicroscopia eletrônica e fracionamento subcelular definiram um subgrupo de endossomos tardios ricos em moléculas de classe II, que desempenham um importante papel na apresentação de antígenos (Fig. 6-18). Nos macrófagos e nas células B humanas, é denominado compartimento MHC de classe II do MHC ou MIIC. (Em algumas células B murinas, foi identificada uma organela semelhante contendo moléculas de classe II, que foi denominada vesícula de classe II.) O MIIC possui um aspecto multilamelar característico na microscopia eletrônica. É importante assinalar que ele contém todos os componentes necessários para a associação peptídeo-classe II, incluindo as enzimas que degradam antígenos proteicos, as moléculas de classe II e duas moléculas envolvidas no carregamento de peptídeos das moléculas de classe II, a cadeia invariante e a HLA-DM, cujas funções são descritas posteriormente.

FIGURA 6-18 Morfologia das vesículas endossômicas ricas em MHC de classe II. A, Imunomicrografia eletrônica de um linfócito B que internalizou albumina sérica bovina em endossomas precoces (marcados com partículas de ouro de 5 nm, seta) e que contém moléculas do MHC de classe II (marcadas com partículas de ouro de 10 nm, cabeças das setas) em MIIC. A albumina internalizada finalmente alcança as MIIC. B, Imunomicrografia eletrônica de uma célula B mostrando a localização das moléculas do MHC de classe II e DM em MIIC (estrelas) e cadeia invariante concentrada no complexo de Golgi (G). Neste exemplo, não existe praticamente nenhuma cadeia invariante detectada na MIIC, presumivelmente por que foi clivada para gerar CLIP.

A, (De Kleijmeer MJ, S Morkowski, JM Griffith, AY Rudensky e HJ Geuze. Major histocompatibility complex class II compartments in human and mouse B lymphoblasts represent conventional endocytic compartments. Reproduzido do The Journal of Cell Biology 139:639-649, 1997, com permissão de copyright da The Rockefeller University Press.) B, (Cortesia de Drs. H. J. Geuze e M. Kleijmeer, Department of Cell Biology, Utrecht University. The Netherlands.)

Biossíntese e Transporte das Moléculas do MHC de Classe II para os Endossomos

As moléculas do MHC de classe II são sintetizadas no RE e transportadas até os endossomos com uma proteína associada, a cadeia invariante (I_i), que ocupa as fendas de ligação de peptídeos das moléculas de classe II recém-sintetizadas (Fig. 6-19). As cadeias α e β das moléculas do MHC de classe II são sintetizadas de modo coordenado e associam-se umas às outras no RE. Os dímeros de classe II nascentes são estruturalmente instáveis, e o seu dobramento e montagem são auxiliados por chaperonas residentes no RE, como a calnexina. Uma proteína denominada cadeia invariante (I_i) promove o enovelamento e a montagem das moléculas de classe II e dirige as moléculas de classe II recém-formadas até os endossomos tardios e lisossomos, onde proteínas internalizadas foram proteoliticamente degradadas em peptídeos. A I_i é um trímero composto de três subunidades de 30 kD, três das quais se ligam a um heterodímero αβ de classe II recém-sintetizado de modo a bloquear a fenda de ligação de peptídeos e impedir que ela aceite qualquer peptídeo. Em consequência, as moléculas do MHC de classe II não podem se ligar a peptídeos que elas encontram no RE nem apresentá-los, possibilitando, assim, a associação desses peptídeos às moléculas de classe I (descritas anteriormente). As moléculas do MHC de classe II são transportadas em vesículas exocíticas até a superfície celular. Durante essa passagem, as vesículas que transportam moléculas de classe II do RE encontram-se e fundem-se com as vesículas endocíticas que contêm antígenos internalizados e processados. Consequentemente, as moléculas de classe II encontram peptídeos antigênicos que foram gerados por proteólise das proteínas que sofreram endocitose, e a associação peptídeo-MHC ocorre nas vesículas.

FIGURA 6-19 As funções da cadeia invariante associada ao MHC de classe II e HLA-DM. As moléculas de classe II com cadeia invariante ligada ou CLIP são transportadas em vesículas, onde I_i é degradada, e o CLIP remanescente é removido pela ação de DM. Os peptídeos antigênicos gerados nas vesículas são então capazes de ligar-se a moléculas de classe II. Outra proteína semelhante à classe II, denominada HLA-DO, pode regular a remoção do CLIP catalisado por DM. CIIV, vesícula de classe II.

Associação dos Peptídeos Processados às Moléculas do MHC de Classe II em Vesículas

No interior das vesículas endossômicas, a I_i dissocia-se das moléculas do MHC de classe II pela ação combinada de enzimas proteolíticas e da molécula HLA-DM, e os peptídeos antigênicos são então capazes de ligar-se às fendas de ligação de peptídeos disponíveis das moléculas de classe II (Fig. 6-19). Como a I_i bloqueia o acesso à fenda de ligação de peptídeos de uma molécula do MHC de classe II, ela precisa ser removida antes da formação de complexos de peptídeos e moléculas de classe II. As mesmas enzimas proteolíticas, como as catepsinas, que geram peptídeos de proteínas internalizadas podem atuar sobre a I_i, degradando-a e deixando apenas um remanescente de 24 aminoácidos, denominado cadeia peptídica invariante associada à classe II (CLIP), que se encontra situado na fenda de ligação de peptídeos da mesma maneira que outros peptídeos ligam-se a moléculas do MHC de classe II. Em seguida, o CLIP precisa ser removido para que a fenda se torne acessível aos peptídeos antigênicos produzidos a partir de proteínas extracelulares. Essa remoção é efetuada pela ação de uma molécula denominada HLA-DM (ou H-2M no camundongo), que é codificada dentro do MHC, possui uma estrutura semelhante àquela das moléculas do MHC de classe II e está colocalizada como moléculas de classe II no compartimento endossômico MIIC. As moléculas de HLA-DM diferem das moléculas do MHC de classe II em vários aspectos; não são polimórficas e não são expressas na superfície celular. A molécula HLA-DM atua como trocador de peptídeo, facilitando a remoção do CLIP e a adição de outros peptídeos a moléculas do MHC de classe II.

Uma vez o CLIP tenha sido removido, os peptídeos gerados por proteólise dos antígenos proteicos internalizados são capazes de ligar-se a moléculas do MHC de classe II. A molécula HLA-DM pode acelerar a taxa de ligação de peptídeos a moléculas de classe II. Como as extremidades da fenda de ligação de peptídeos do MHC de classe II estão abertas, os grandes peptídeos podem ligar-se e, em seguida, podem ser “reduzidos” por enzimas proteolíticas ao tamanho apropriado para o seu reconhecimento pelas células T. Portanto, os peptídeos que são realmente apresentados pelas moléculas do MHC de classe II na superfície celular têm habitualmente um comprimento de 10 a 30 aminoácidos e foram tipicamente gerados por essa etapa de redução.

Expressão dos Complexos Peptídeo-MHC de Classe II na Superfície Celular

As moléculas do MHC de classe II são estabilizadas pelos peptídeos ligados, e os complexos peptídeo-classe II estáveis são transportados até a superfície da APC, onde são apresentados para o seu reconhecimento por células T CD4⁺. Acredita-se que o transporte de complexos MHC de classe II-peptídeo até a superfície celular ocorra por fusão de extensões vesiculotubulares do lisossomo com a membrana plasmática, resultando na liberação dos complexos de MHC de classe II transportados na superfície celular. Uma vez expressos na superfície das APC, os complexos peptídeo-classe II são reconhecidos por células T CD4⁺ específicas para antígenos proteicos, e, nesse processo, o correceptor CD4 desempenha um papel essencial através de sua ligação a regiões não polimórficas da molécula de classe II. É interessante ressaltar que, enquanto as moléculas de classe II carregadas de peptídeos deslocam-se dos endossomos tardios e lisossomos até a superfície celular, outras moléculas envolvidas na apresentação de antígenos, como DM, permanecem dentro das vesículas e não são expressas na membrana plasmática. O mecanismo desse trânsito seletivo não é conhecido.

Natureza das Respostas das Células T

A apresentação de proteínas citosólicas versus vesiculares pelas vias do MHC de classe I ou de classe II, respectivamente, determina quais os subtipos de células T que responderão aos antígenos encontrados nesses dois reservatórios de proteínas e está estreitamente ligada às funções dessas células (Fig. 6-21). Os antígenos com síntese endógena, como as proteínas virais e tumorais, localizam-se no citoplasma e são reconhecidos por CTL CD8⁺ restritos à classe I, que eliminam as células que produzem os antígenos intracelulares. Por sua vez, os antígenos extracelulares habitualmente são captados em vesículas endossômicas e ativam células T CD4⁺ restritas à classe II, visto que as proteínas vesiculares são processadas em peptídeos de ligação da classe II. As células T CD4⁺ atuam como células auxiliares para estimular as células B a produzirem anticorpos e os macrófagos a intensificarem a sua atividade fagocítica, ambos os mecanismos atuam para eliminar os antígenos extracelulares. Por conseguinte, os antígenos de micro-organismos que residem em diferentes locais celulares estimulam seletivamente as respostas das células T que são mais efetivas na eliminação desse tipo de micro-organismo. Isso é particularmente importante uma vez que os receptores de antígenos dos CTL e das células T auxiliares são incapazes de distinguir entre micro-organismos extracelulares e intracelulares. Através da segregação de peptídeos derivados desses tipos de micro-organismos, as moléculas do MHC orientam os subtipos de células T CD4⁺ e CD8⁺ a responderem aos micro-organismos que podem ser mais bem atacados por cada um desses subtipos.

FIGURA 6-21 Apresentação dos antígenos extracelulares e citosólicos a diferentes subtipos de células T. A, Os antígenos citosólicos são apresentados por células nucleadas aos CTL CD8⁺, que eliminam (lisam) as células que expressam antígenos. B, Os antígenos extracelulares são apresentados por macrófagos ou por linfócitos B aos linfócitos T CD4⁺auxiliares, que ativam os macrófagos ou as células B e eliminam os antígenos extracelulares.

Imunogenicidade dos Antígenos Proteicos

As moléculas do MHC determinam a imunogenicidade dos antígenos proteicos de duas maneiras relacionadas.

FIGURA 6-22 Imunodominância dos peptídeos. Os antígenos proteicos são processados para gerar múltiplos peptídeos; os peptídeos imunodominantes são aqueles que se ligam melhor às moléculas do MHC de classe I e de classe II disponíveis. A ilustração mostra um antígeno extracelular gerando um peptídeo de ligação à classe II, porém isso também se aplica aos peptídeos dos antígenos citosólicos que são apresentados por moléculas do MHC de classe I.