Organização dos Loci Gênicos das Ig

Três loci separados codificam, respectivamente, todas as cadeias pesadas e as cadeias leves κ e λ das Ig. Cada lócus encontra-se em um cromossomo diferente. A Figura 8-5 ilustra a organização dos genes das Ig humanas, enquanto a relação dos segmentos gênicos, após o rearranjo, com os domínios das proteínas das cadeias pesadas e leves das Ig é mostrada na Figura 8-6A. Os genes das Ig estão organizados essencialmente da mesma forma em todos os mamíferos, embora a sua localização cromossômica e o número e a sequência dos diferentes segmentos gênicos em cada lócus possam variar.

FIGURA 8-5 Organização dos loci das Ig humanas na linhagem germinativa. São mostrados os loci das cadeias pesadas e das cadeias leves κ e λ humanas. Apenas os genes funcionais são mostrados; os pseudogenes foram omitidos para maior simplicidade. Os éxons e os íntrons não estão representados na escala. Cada gene C_H é representado como único quadrado, porém é composto de vários éxons, conforme ilustrado para C_μ. Os segmentos gênicos estão indicados da seguinte forma: L, líder (frequentemente denominado sequência de sinal); V, variável; D, diversidade; J, junção; C, constante; enh, amplificador.

FIGURA 8-6 Domínios das proteínas Ig e TCR. Em A, são mostrados os domínios das cadeias pesada e leve das Ig, e, em B, os domínios das cadeias α e β do TCR. As relações entre os segmentos gênicos das Ig e TCR e a estrutura dos domínios das cadeias polipeptídicas do receptor de antígenos estão indicadas. As regiões V e C de cada polipeptídio são codificadas por diferentes segmentos gênicos. As localizações das ligações de dissulfeto (S-S) intracadeia e entre cadeias são aproximadas. As áreas nos retângulos tracejados representam as regiões hipervariáveis (que determinam a complementaridade). Na cadeia μ das Ig e nas cadeias α e β dos TCRs, os domínios transmembrana (TM) e citoplasmático (CIT) são codificados por éxons separados.

Na extremidade 5′ de cada um dos loci das Ig, existe um segmentos gênico que contém diferentes genes chamados V, e cada gene V possui cerca de 300 pares de bases. O número de genes V varia consideravelmente entre os diferentes loci das Ig e entre espécies diferentes. Por exemplo, existem cerca de 35 genes V no lócus da cadeia leve κ humana, cerca de 30 no lócus λ e cerca de 100 genes V funcionais no lócus da cadeia pesada humana; enquanto o lócus da cadeia leve λ do rato tem apenas dois genes V e o lócus da cadeia pesada do rato possui mais de 1.000 genes V. Os segmentos gênicos V em cada lócus estão espaçados por intervalos longos de DNA, de até 2.000 quilobases de comprimento. Na extremidade 5′ de cada segmento V, existe um éxon líder, que codifica de 20 a 30 resíduos N-terminais na proteína traduzida. Esses resíduos são moderadamente hidrofóbicos e formam o peptídio líder (ou sinal). São encontradas sequências de sinais em todas as proteínas secretadas e transmembrana recém-sintetizada, que estão envolvidas na orientação dos polipeptídios nascentes traduzidos nos ribossomos ligados à membrana no lúmen do retículo endoplasmático. No retículo endoplasmático, as sequências sinais são rapidamente clivadas e não estão presentes nas proteínas maduras. Próximo a cada éxon líder, encontra-se um promotor do gene V onde a transcrição pode ser iniciada; entretanto, conforme discutido adiante, isso ocorre de modo mais eficiente após o rearranjo.

Em distâncias variáveis de 3′ dos genes V, encontram-se vários segmentos J estreitamente ligados aos éxons que codificam a região constante, que são encontrados mais distalmente. Os segmentos J têm, normalmente, um comprimento de 30 a 50 pares de base e são separados por sequências não codificadoras. Entre os segmentos V e J no lócus IgH, existem segmentos adicionais, conhecidos como segmentos D. À semelhança dos genes V, o número de genes J e D varia em diferentes loci das Ig e em espécies diferentes.

Cada lócus de Ig possui o arranjo distinto e número variados de genes que codificam a região C. Nos seres humanos, o lócus da cadeia leve κ possui um único gene C (C_κ), e o lócus da cadeia leve λ possui quatro genes C (C_λ) funcionais. O lócus da cadeia pesada das Ig tem nove genes C (C_H), dispostos em fileira, que codificam as regiões C dos nove isótipos diferentes e subgrupos de Ig (Cap. 5). Cada gene C_κ e C_λ é composto de um único éxon, que codifica todo o domínio C das cadeias leves. Por sua vez, cada gene C_H é constituído de cinco ou seis éxons. Três ou quatro éxons (cada um deles com tamanho semelhante a um segmento gênico V) codificam, cada um deles, um domínio C_H da cadeia pesada das Ig, enquanto dois éxons menores codificam as extremidades carboxiterminais da forma associada à membrana de cada cadeia pesada das Ig, incluindo os domínios transmembrana e citoplasmático das cadeias pesadas (Fig. 8-6A).

A proteína das cadeias leves de Ig (κ ou λ), o domínio V é codificado pelos segmentos gênicos V e J; a proteína das cadeias pesadas de Ig, o domínio V é codificado pelos segmentos gênicos V, D e J (Fig. 8-6A). Todos os resíduos de junção entre os segmentos V e D e os segmentos D e J rearranjados, bem como a sequência dos próprios segmentos D e J, formam a terceira região hipervariável (também conhecida como região determinante da complementaridade 3 ou CDR3) no caso dos domínios V de IgH e β do TCR. As sequências juncionais entre os segmentos V e J rearranjados, bem como o próprio segmento J, constituem a terceira região hipervariável das cadeias leves de Ig. Os CDR1 e CDR2 são codificados no próprio segmento gênico V da linhagem germinativa. Os domínios V e C das moléculas de Ig compartilham características estruturais, incluindo uma estrutura terciária, denominada dobra da Ig. Conforme discutido no Capítulo 5, as proteínas que incluem essa estrutura são membros da superfamília das Ig.

As sequências não codificadoras nos loci das Ig desempenham papéis importantes na recombinação e na expressão dos genes. Conforme discutido mais adiante, as sequências que ditam a recombinação de diferentes segmentos gênicos são encontradas adjacentes a cada segmento codificador nos genes de Ig. Existem também promotores do gene V e outros elementos reguladores de atuação cis, como as regiões de controle do lócus, amplificadores e silenciadores, que regulam a expressão gênica em nível da transcrição.

Organização dos Loci dos Genes dos TCR

Os genes que codificam as cadeias α, β e γ dos TCR estão mapeados em três loci distintos em três cromossomos diferentes, enquanto o lócus da cadeia δ dos TCR encontra-se dentro do lócus α do TCR (Fig. 8-7). Cada lócus de TCR na linhagem germinativa inclui segmentos gênicos V e J, estando este último exatamente proximal aos éxons da região C em cada lócus. Além disso, os loci TCR β e TCR δ também possuem segmentos D, como o lócus das cadeias pesadas de Ig. Na extremidade 5′ de cada um dos loci dos TCR, existe um grupamento de vários segmentos gênicos V, dispostos de forma muito semelhante aos segmentos gênicos V das Ig. Numa posição proximal a cada gene V de TCR, há um éxon que codifica um peptídio líder, e, adjacente a cada éxon líder, existe um promotor para cada gene V.

FIGURA 8-7 Organização dos loci dos TCR humanos na linhagem germinativa. São mostrados os loci das cadeias β, α, γ e δ dos TCR humanos. Os éxons e os íntrons não estão representados na escala, e os pseudogenes não funcionais não estão ilustrados. Cada gene C é mostrado como um único retângulo, porém é composto de vários éxons, como ilustrado para C_β1. Os segmentos gênicos estão indicados da seguinte forma: L, líder (habitualmente denominada sequência de sinal); V, variável; D, diversidade; J, junção; C, constante; enh, amplificador; sil, silenciador (sequências que regulam a transcrição dos genes dos TCR).

Em cada lócus de TCR, à semelhança dos loci das Ig, os genes da região C estão localizados exatamente em 3′ dos segmentos J. Existem dois genes C em cada um dos loci de TCR β (C_β) e TCR γ (C_γ) humanos, e apenas um gene C em cada um dos loci TCR α (C_α) e TCR δ (C_δ). Cada gene da região C do TCR é composto de quatro éxons, que codificam o domínio semelhante à região C extracelular das Ig, uma região de dobradiça curta, o segmento transmembrana e a cauda citoplasmática. Os loci das cadeias β e δ dos TCR assemelham-se ao lócus das cadeias pesadas de Ig e contêm segmentos D entre os genes V e os segmentos J. Cada gene C do TCR humano encontra-se imediatamente a 3′ dos segmentos J. Nas cadeias α ou γ dos TCR (análogas às cadeias leves das Ig), o domínio V é codificado pelos éxons V e J; ao passo que, nas proteínas β e δ do TCR, o domínio V é codificado pelos segmentos gênicos V, D e J.

A Figura 8-6B mostra a relação dos segmentos gênicos dos TCR e as porções correspondentes das proteínas do TCR que elas codificam. Como nas moléculas de Ig, os domínios V e C dos TCR assumem uma estrutura terciária contendo dobras típicas das Ig, e, por conseguinte, o TCR é um membro da superfamília de proteínas da Ig.

Sinais de Reconhecimento que Impulsionam a Recombinação V(D)J

Fatores críticos específicos dos linfócitos, que medeiam a recombinação V(D)J, reconhecem determinadas sequências de DNA, denominadas sequências sinais de recombinação (RSS), localizadas em 3′ de cada segmento gênico V, 5′ de cada segmento J e ambos os lados de cada segmento D (Fig. 8-10A). Os RSS consistem em um segmento altamente conservado de sete nucleotídios, denominado heptâmero, normalmente CACAGTG, de localização adjacente à sequência codificadora, seguida de um espaçador contendo exatamente 12 ou 23 nucleotídios não conservados, seguido de um segmento altamente conservado de nove nucleotídios, rico em AT, denominado nanômero. Os espaçadores de 12 e de 23 nucleotídios correspondem a cerca de uma ou duas voltas da hélice de DNA, respectivamente, e presume-se que eles colocam dois heptâmeros distintos em posições simultaneamente acessíveis às enzimas que catalisam o processo de recombinação.

FIGURA 8-10 Recombinação V(D)J. São mostradas as sequências de DNA e os mecanismos envolvidos na recombinação dos loci dos genes das Ig. As mesmas sequências e mecanismos aplicam-se à recombinação dos loci dos TCR. A, As sequências de heptâmero (7 pb) e nonâmero (9 pb) conservadas, separadas por espaçadores de 12 ou 23 pb, estão adjacentes aos éxons V e J (para os loci κ e λ) ou aos éxons V, D e J (no lócus da cadeia H). A V(D)J recombinase reconhece essas sequências de sinais de recombinação e aproxima os éxons. B, C. A recombinação dos éxons V e J pode ocorrer por deleção do DNA entre eles e pela ligação dos segmentos V e J (B) ou, se o gene V estiver na orientação oposta, pela inversão do DNA, seguida de ligação dos segmentos gênicos adjacentes (C). As setas vermelhas indicam os locais onde as sequências das linhagens germinativas são clivadas antes de sua ligação a outros segmentos gênicos das Ig ou dos TCR.

Durante a recombinação V(D)J, são produzidas quebras de filamento duplo entre o heptâmero da RSS e a sequência adjacente que codifica V, D e J. Por exemplo, na recombinação V-para-J da cadeia leve das Ig, são feitas quebras em 3′ de um segmento V e 5′ de um segmento J. O DNA de filamento duplo interveniente, que contém as extremidades de sinais (as extremidades que contêm o heptâmero e o resto da RSS), é removido na forma de um círculo, e esse processo é acompanhado da junção das extremidades que codificam V e J (Fig. 8-10B). Alguns genes V, em particular, no lócus κ das Ig, estão na mesma orientação que os segmentos J, de modo que o RSS em 5′ desses segmentos V e 3′ dos segmentos J não estão na “frente” um do outro. Nesses casos, o DNA interveniente é invertido, os éxons V e J são alinhados apropriadamente e as RSS fundidas não sofrem deleção, porém são retidas no cromossomo (Fig. 8-10C). A maior parte dos rearranjos dos genes das Ig e dos TCR ocorre por deleção; ocorre rearranjo por inversão em até 50% dos rearranjos no lócus κ. A recombinação entre dois segmentos só ocorre se um dos segmentos estiver ladeado por um espaçador de 12 nucleotídios e se o outro estiver ladeado por um espaçador de 23 nucleotídios, constituindo a denominada regra 12/23. Por conseguinte, um segmento codificador com uma RSS de “uma volta” sempre se combina com um segmento codificador com uma RSS de “duas voltas”. O tipo de RSS que ladeia (uma volta ou duas voltas) assegura a recombinação dos segmentos gênicos apropriados. Por exemplo, no lócus da cadeia pesada das Ig, as RSS que ladeiam ambos os segmentos V e J apresentam espaçadores de 23 nucleotídios (duas voltas) e, por conseguinte, não podem unir-se diretamente; primeiro, ocorre recombinação D-para-J, seguida de recombinação de V-para-DJ, e isso é possível pelo fato de que os segmentos D são cercados, em ambos os lados, por espaçadores de 12 nucleotídios, permitindo a junção D-J e então V-DJ. As RSS descritas aqui são exclusivas dos genes das Ig e dos TCR. Por conseguinte, a recombinação V(D)J pode ocorrer nos genes dos receptores de antígenos, mas não em outros genes.

Uma das consequências da recombinação V(D)J é que o processo aproxima promotores, localizados imediatamente em 5′ dos genes V, com amplificadores distais, que estão localizados nos íntrons J-C e também em 3′ dos genes da região C (Fig. 8-11). Esses amplificadores maximizam a atividade de transcrição dos promotores do gene V e, portanto, são importantes para a transcrição de alto nível dos genes V rearranjados nos linfócitos. Como os genes das Ig e dos TCR constituem locais de múltiplos eventos de recombinação do DNA nas células B e T e como esses locais tornam-se ativos para transcrição após a recombinação, os genes de outros loci podem ser anormalmente translocados para esses loci e, em consequência, podem ser transcritos de modo anormal. Nos tumores de linfócitos B e T, os oncogenes são, com frequência, translocados para os loci dos genes das Ig ou dos TCR. Essas translocações cromossômicas são, com frequência, acompanhadas de aumento da transcrição dos oncogenes, e acredita-se que seja um dos fatores que causam o desenvolvimento de tumores linfoides.

FIGURA 8-11 Regulação da transcrição dos genes Ig. A recombinação V-D-J aproxima as sequências promotoras (ilustradas como P) do amplificador (enh). O amplificador promove a transcrição do gene V rearranjado (V2, cujo promotor ativo está indicado por uma seta verde). Muitos genes de receptores possuem um amplificador no íntron J-C e outro 3′ da região C. Apenas o amplificador 3′ está ilustrado aqui.

O Mecanismo de Recombinação V(D)J

O rearranjo dos genes das Ig e dos TCR representa um tipo especial de recombinação não homóloga do DNA, mediado pelas atividades coordenadas de várias enzimas, algumas das quais são encontradas apenas nos linfócitos em desenvolvimento, enquanto outras são enzimas ubíquas de reparo de quebras de filamento duplo do DNA (DSBR). Embora o mecanismo de recombinação V(D)J esteja bastante elucidado e seja descrito aqui, ainda não foi estabelecido como exatamente os loci específicos tornam-se acessíveis ao processo envolvido na recombinação. É provável que a acessibilidade dos loci das Ig e dos TCR às enzimas que medeiam a recombinação seja regulada, nas células B e T em desenvolvimento, por diversos mecanismos, incluindo alterações na estrutura da cromatina, metilação do DNA e atividade de transcrição basal nos loci gênicos.

O processo de recombinação V(D)J pode ser dividido em quatro eventos distintos, que seguem um fluxo sequencial (Fig. 8-12):

1. Sinapse: Porções do cromossomo no qual está localizado o gene do receptor de antígenos que tornam-se acessíveis ao processo de recombinação. Dois segmentos codificadores selecionados e suas RSS adjacentes são aproximados por um evento formador de uma alça no cromossomo, sendo mantidos nessa posição para clivagem, processamento e junção subsequentes.

2. Clivagem: Quebras de filamento duplo são produzidas enzimaticamente nas junções das sequências codificadoras de RSS por um mecanismo que é específico das células linfoides. Duas proteínas codificadas por genes linfoides específicos, denominadas gene ativador da recombinação 1 e gene ativador da recombinação 2 (Rag-1 e Rag-2), formam um complexo tetramérico que desempenha papel essencial na recombinação V(D)J. O complexo Rag-1/Rag-2 é também conhecido como V(D)J recombinase. A proteína Rag-1, de forma semelhante a uma endonuclease de restrição, reconhece a sequência de DNA na junção entre um heptâmero e um segmento codificador, clivando-o, porém só é ativa enzimaticamente quando complexada com a proteína Rag-2. A proteína Rag-2 pode ajudar a ligar o tetrâmero Rag-1/Rag-2 a outras proteínas, incluindo fatores de acessibilidade, que levam essas proteínas até loci gênicos de receptores “abertos” específicos, em momentos determinados e em estágios definidos do desenvolvimento dos linfócitos. A Rag-1 e a Rag-2 contribuem para manter unidos os segmentos gênicos durante o processo de dobramento ou sinapse do cromossomo. Em, seguida, a Rag-1 faz um corte (em um filamento) entre a extremidade codificadora e o heptâmero. O terminal 3′ OH, liberado da extremidade codificadora, ataca então uma ligação fosfodiéster no outro filamento, formando uma estrutura covalente semelhante a um grampo. A extremidade sinal (incluindo o heptâmero e o restante da RSS) não forma uma estrutura em forma de grampo e é gerada como uma terminação romba de DNA de filamento duplo, que não é mais processada. Essa quebra de filamento duplo resulta em um grampo fechado de um segmento codificador mantido em aposição ao grampo fechado da outra extremidade codificadora e duas extremidades de sinais rombas de recombinação são colocadas uma ao lado da outra. Além de produzir as quebras de filamento duplo, a Rag-1 e a Rag-2 também mantêm as extremidades dos grampos e as extremidades rombas unidas antes da modificação das extremidades codificadoras e do processo de ligação.

FIGURA 8-12 Eventos sequenciais durante a recombinação V(D)J. A sinapse e a clivagem do DNA no limite heptâmero/segmento codificador são mediadas pela Rag-1 e Rag-2. O grampo na extremidade codificadora é aberto pela endonuclease Artemis, e ocorre reparo das extremidades quebradas pelo mecanismo NHEJ.

Os genes Rag são específicos dos linfócitos e são expressos apenas nas células B e T em desenvolvimento. As proteínas Rag são expressas principalmente nos estágios G₀ e G₁ do ciclo celular e são inativadas nas células em proliferação. Acredita-se que a limitação da clivagem e da recombinação do DNA a esses estágios minimiza o risco de gerar quebras inapropriadas do DNA durante a sua replicação ou durante a mitose.

3. Abertura do grampo e processamento das extremidades: As extremidades codificadoras quebradas (mas não as extremidades sinais/RSS) são modificadas pela adição ou remoção de bases, com consequente geração de uma maior diversidade. Após a formação de quebras de filamento duplo, os grampos devem ser abertos nas junções codificadoras, e as bases podem ser adicionadas ou removidas das extremidades codificadoras para assegurar uma diversificação ainda maior. A Artemis é uma endonuclease que abre os grampos nas extremidades codificadoras. Na ausência de Artemis, os grampos não podem ser abertos e não pode haver geração de células T e B maduras. Uma imunodeficiência rara, caracterizada pela ausência de célula T e B, é causada por mutações no Artemis (Cap. 20). Uma enzima específica do tecido linfoide, denominada desoxinucleotidil transferase terminal (TdT), acrescenta bases às extremidades quebradas do DNA pela ação da Artemis e é discutida posteriormente, neste capítulo, no contexto da diversidade juncional.

4. Junção: As extremidades codificadoras quebradas, bem como as extremidades de sinais, são aproximadas e ligadas por um processo de reparo de quebras de filamento duplo encontrado em todas as células, denominado junção terminal não homóloga. Diversos fatores ubíquos participam da junção terminal não homóloga. A Ku70 e a Ku80 são proteínas que ligam as extremidades do DNA quebradas e assim recrutam a subunidade catalítica da proteinocinase dependente de DNA (DNA-PK), uma enzima de reparo do DNA de filamento duplo. Essa enzima está deficiente em camundongos portadores da mutação que causa imunodeficiência combinada grave (scid) (Cap. 20). Assim como os camundongos deficientes em Rag, os camundongos com scid são incapazes de produzir linfócitos maduros. A DNA-PK também fosforila e ativa a Artemis, que, conforme mencionado, está envolvida no processamento das extremidades. A ligação das extremidades quebradas processadas é mediada pela DNA ligase IV e pela XRCC4, sendo esta última uma subunidade não catalítica, porém essencial dessa ligase.

Estágios Pró-B e Pré-B de Desenvolvimento das Células B

A primeira célula da medula óssea comprometida com a linhagem de células B é denominada célula pró-B. As células pró-B não produzem Ig, mas podem ser distinguidas de outras células imaturas pela expressão de moléculas de superfície restritas à linhagem B, como CD19 e CD10. As proteínas Rag são inicialmente expressas nesse estágio, e a primeira recombinação dos genes das Ig ocorre no lócus das cadeias pesadas. Essa recombinação aproxima um segmento gênico D e um segmento gênico J, com deleção do DNA intercalado entre eles (Fig. 8-15A). Os segmentos D que estão em 5′ do segmento D rearranjado e os segmentos J que estão em 3′ do segmento J rearranjado não são afetados por essa recombinação (p. ex., D1 e J2 para J6 na Fig. 8-15A). Após a ocorrência da recombinação D-J, um dos numerosos genes V 5′ une-se à unidade DJ, dando origem a um éxon VDJ rearranjado. Nesse estágio, todos os segmentos V e D entre os genes V e D rearranjados também sofrem deleção. A recombinação V-para-DJ no lócus da cadeia H das Ig só ocorre nos precursores comprometidos dos linfócitos B e constitui um evento crítico na expressão das Ig, visto que apenas o gene V rearranjado é subsequentemente transcrito. A enzima TdT, que catalisa a adição sem modelo dos nucleotídios N juncionais, é expressa de modo mais abundante durante o estágio pró-B, quando ocorre a recombinação VDJ no lócus Ig H, e os níveis de TdT diminuem antes de completar a recombinação V-J dos genes das cadeias leves. Por isso, a diversidade juncional atribuída à adição de nucleotídios N é mais proeminente nos genes rearranjados das cadeias pesadas do que nos genes das cadeias leves. Os éxons da região C das cadeias pesadas permanecem separados do complexo VDJ por DNA contendo os segmentos J distais e o íntron J-C. O gene das cadeias pesadas de Ig rearranjado é transcrito para produzir um produto de transcrição primária que inclui o complexo VDJ rearranjado e os éxons C_μ. O RNA nuclear C_μ é clivado distalmente a um de dois locais de poliadenilação de consenso, e múltiplos nucleotídios de adenina, denominados caudas de poli-A, são adicionados à extremidade 3′. Esse RNA nuclear sofre maturação (splicing), um evento no processamento do RNA, em que os íntrons são removidos, e os éxons são unidos. No caso do RNAμ, os íntrons entre o éxon líder e o éxon VDJ, entre o éxon VDJ e o primeiro éxon do lócus C_μ e entre cada um dos éxons subsequentes da região constante de C_μ, são removidos dando origem, assim, a um mRNA cuja a porção constante da cadeia pesada é do tipo μ (IgM). Se o mRNA for derivado de um lócus de Ig, em que o arranjo foi produtivo, a tradução do mRNA da cadeia pesada μ rearranjado leva à síntese da proteína μ. Para que um rearranjo seja produtivo (na fase de leitura correta), é preciso que haja adição ou remoção de bases nas junções em múltiplos de três. Isso assegura que o gene das Ig rearranjado seja capaz de codificar de forma correta uma proteína de Ig. Cerca da metade de todas as células pró-B realiza rearranjos produtivos no lócus H da Ig em pelo menos um cromossomo e, portanto, pode sintetizar a proteína da cadeia pesada μ. Apenas as células que fazem rearranjos produtivos sobrevivem e continuam a se diferenciar.

FIGURA 8-15 Recombinação e expressão dos genes das cadeias pesadas e leves das Ig. São mostrados a sequência de recombinação do DNA e os eventos de expressão dos genes para a cadeia pesada μ (A) e a cadeia leve κ (B) das Ig. No exemplo apresentado em A, a região V da cadeia pesada μ é codificada pelos éxons V1, D2 e J1. No exemplo mostrado em B, a região V da cadeia κ é codificada pelos éxons V2 e J1.

Uma vez realizado um rearranjo μ de Ig produtivo, a célula não é mais denominada célula pró-B e já está diferenciada no estágio pré-B. As células pré-B são células de linhagem B em desenvolvimento, que expressam a proteína μ das Ig, mas que ainda precisam rearranjar os loci das cadeias leves. A célula pré-B expressa a cadeia pesada μ na superfície celular, em associação a outras proteínas, como o pré-receptor de células B, que desempenha várias funções importantes na maturação das células B.

O Receptor de Células Pré-B

O pré-receptor de antígenos da linhagem B, conhecido como receptor da célula pré-B (pré-BCR), é formado por complexos de cadeias leves substitutas, de μ e por proteínas de transdução de sinais, denominadas Ig α e Ig β. A cadeia pesada μ associa-se às proteínas λ5 e pré-B V, também denominadas cadeias leves substitutas, visto que são estruturalmente homólogas às cadeias leves κ e λ, porém não apresentam variação (i. e., são idênticas em todas as células pré-B) e são sintetizadas apenas nas células pró-B e pré-B (Fig. 8-16A). A Igα e a Igβ também fazem parte do receptor de células B nas células B maduras (Cap. 7). Os sinais do pré-BCR impulsionam a transição de pró-B para pré-B e são responsáveis pela maior expansão proliferativa das células de linhagem B na medula óssea. Não se sabe o que e o pré-BCR reconhece; na atualidade, o ponto de vista consensual é de que esse receptor atua de forma independente do ligante, sendo ativado pelo processo de montagem (i. e., o receptor, após a sua montagem completa, encontra-se no modo “ligado”). A importância dos pré-BCRs é ilustrada por estudos de camundongos nocauteados (knockouts) e por raros casos de deficiência desses receptores em seres humanos. Por exemplo, nos camundongos, a deficiência do gene que codifica a cadeia μ, ou que codifica uma das cadeias leves substitutas, resulta em uma acentuada redução no número de células B maduras, visto que o desenvolvimento é bloqueado no estágio pró-B.

FIGURA 8-16 Receptores das células pré-B e pré-T. O receptor da célula pré-B (A) e o receptor da célula pré-T (B) são expressos durante os estágios de maturação das células pré-B e pré-T, respectivamente, e ambos os receptores compartilham estruturas e funções similares. O receptor da célula pré-B é composto da cadeia pesada μ e de uma cadeia leve substituta invariável. A cadeia leve substituta é composta de duas proteínas, a proteína V pré-B, que é homóloga ao domínio V da cadeia leve, e a proteína λ5, que está ligada de modo covalente à cadeia pesada μ por uma ligação de dissulfeto. O receptor da célula pré-T é composto da cadeia β do TCR e da cadeia α pré-T (pTα) invariável. O receptor de células pré-B está associado às moléculas de sinalização Igα e Igβ, que fazem parte do complexo do BCR nas células B maduras (Cap. 9), enquanto o receptor de células pré-T está associado às proteínas CD3 e ζ, que fazem parte do complexo do TCR nas células T maduras (Cap. 7).

A expressão do pré-BCR constitui o primeiro ponto de controle na maturação das células B. São necessárias numerosas moléculas de sinalização ligadas ao pré-BCR e aos BCRs para que as células ultrapassem, com sucesso, o ponto de controle mediado pelo pré-BCR na transição de pró-B para pré-B. Uma cinase, denominada tirosinocinase de Bruton (Btk), é ativada distalmente ao pré-BCR e é necessária para transmitir sinais desse receptor, que medeiam a sobrevida, a proliferação e a maturação no estágio de célula pré-B e além dele. Nos seres humanos, a ocorrência de mutações no gene BTK provoca uma doença denominada agamaglobulinemia ligada ao X (XLA), caracterizada por uma incapacidade de maturação das células B (Cap. 20). Nos camundongos, as mutações de btk resultam em um defeito menos grave das células B em uma cepa de camundongos denominada Xid (imunodeficiência ligada ao X, do inglês, X-linked immunodeficiency). O defeito é menos grave do que na XLA, visto que as células pré-B murinas expressam uma segunda cinase semelhante à Btk, denominada Tec, que compensa a Btk deficiente.

O pré-BCR regula o rearranjo adicional dos genes das Ig de duas formas. Na primeira, se uma proteína μ for produzida do lócus recombinado das cadeias pesadas em um cromossomo e formar um pré-BCR, esse receptor emite um sinal para inibir irreversivelmente o rearranjo do lócus das cadeias pesadas de Ig no outro cromossomo. Se o primeiro rearranjo não for produtivo, o alelo das cadeias pesadas no outro cromossomo pode completar o rearranjo VDJ no lócus H das Ig. Assim, em qualquer clone de células B, um alelo da cadeia pesada sofre rearranjo produtivo e é expresso, enquanto o outro é retido na configuração da linhagem germinativa ou sofre rearranjo não produtivo. Como resultado, uma célula pode expressar proteínas das cadeias pesadas de Ig codificadas por apenas um dos dois alelos herdados. Esse fenômeno é denominado exclusão alélica e assegura que cada célula B irá expressar um único receptor, mantendo, assim, a especificidade clonal. Se ambos os alelos sofrem rearranjos não produtivos do gene H das Ig, a célula em desenvolvimento é incapaz de produzir cadeias pesadas de Ig, não pode gerar um sinal de sobrevida dependente do pré-BCR e, portanto, sofre morte celular programada. A exclusão alélica das cadeias pesadas de Ig envolve alterações na estrutura da cromatina no lócus das cadeias pesadas, limitando a acessibilidade à V(D)J recombinase.

A segunda forma pela qual o pré-BCR regula a produção do receptor de antígenos consiste na estimulação do rearranjo do gene da cadeia leve κ. Todavia, a expressão da cadeia μ não é absolutamente necessária para a recombinação do gene da cadeia leve, conforme demonstrado pelo achado de que camundongos nocautes (knockouts), que carecem do gene μ, iniciam rearranjos do gene da cadeia leve em algumas células B em desenvolvimento (que, naturalmente, não podem expressar receptores de antígenos funcionais e prosseguir no processo de maturação). O pré-BCR também contribui para a inativação da expressão dos genes de cadeias leves substitutas à medida que as células pré-B amadurecem.

Células B Imaturas

Após o estágio de célula pré-B, cada célula B em desenvolvimento rearranja inicialmente um gene da cadeia leve κ, e, se o rearranjo for produtivo, irá gerar uma proteína da cadeia leve κ, que se associa à cadeia μ previamente sintetizada para produzir uma proteína IgM completa. Se não houver rearranjo produtivo do lócus κ, a célula pode rearranjar o lócus λ e novamente produzir uma molécula IgM completa. (A indução do rearranjo do gene da cadeia leve λ ocorre principalmente quando os receptores das células B que expressam κ da Ig são autorreativos, conforme discutido adiante.) A célula B que expressa IgM é denominada célula B imatura. A recombinação do DNA no lócus da cadeia leve κ ocorre de modo semelhante à do lócus das cadeias pesadas de Ig (Fig. 8-15B). Não há segmentos D nos loci das cadeias leves, e, por conseguinte, a recombinação envolve apenas a junção de um segmento V com um segmento J, formando um éxon VJ. Esse éxon VJ permanece separado da região C por um íntron, e essa separação é retida na transcrição primária do RNA. O processamento (splicing) do produto de transcrição primária leva à remoção do íntron entre os éxons VJ e C e gera um mRNA, que é traduzido para produzir a proteína κ ou λ. No lócus λ, o processamento (splicing) alternativo do RNA pode levar ao uso de qualquer um dos quatro éxons C_λ funcionais, porém não existe nenhuma diferença funcional conhecida entre os tipos resultantes de cadeias leves λ. A produção de uma proteína κ impede o rearranjo λ, e, conforme mencionado, o rearranjo λ só ocorre se o rearranjo κ não for produtivo ou se ocorrer deleção de uma cadeia leve κ rearranjada autorreativa. Como resultado, um clone de células B só pode expressar um dos dois tipos de cadeias leves; esse fenômeno é denominado exclusão do isótipo de cadeia leve. Como no caso do lócus da cadeia pesada, a expressão de κ ou λ sofre exclusão alélica e só é iniciada em um dos dois cromossomos herdados em qualquer momento determinado. Além disso, como no caso das cadeias pesadas, se ambos os alelos para as cadeias κ e λ não forem funcionais em uma célula B em desenvolvimento, essa célula não recebe sinais de sobrevida normalmente gerados pelo BCR e, consequentemente, morre.

As moléculas de IgM montadas são expressas na superfície celular, em associação a Igα e Igβ, onde funcionam como receptores específicos de antígenos. Nas células não fortemente autorreativas, o BCR fornece sinais centrais que são independentes de ligante, mas que mantêm a célula B viva ao mesmo tempo que inibe a expressão do gene Rag, impedindo, assim, qualquer rearranjo adicional dos genes das Ig. As células B imaturas não proliferam e não se diferenciam em resposta a antígenos. De fato, quando reconhecem antígenos na medula óssea com alta afinidade, o que pode ocorrer se as células B expressam receptores para antígenos próprios multivalentes presentes na medula óssea, as células B podem sofrer edição do receptor ou morte celular, conforme descrito adiante. Esses processos são importantes para a seleção negativa das células B fortemente autorreativas. As células B imaturas que não são fortemente autorreativas deixam a medula óssea e completam a sua maturação no baço, antes de migrar para outros órgãos linfoides periféricos.

Subgrupos de Células B Maduras

Subgrupos distintos de células B desenvolvem-se de diferentes progenitores (Fig. 8-17). As CTH derivadas do fígado fetal são os precursores das células B-1, descritas adiante. As CTH derivadas da medula óssea dão origem à maior parte das células B, algumas vezes denominadas células B-2. Essas células passam rapidamente por dois estágios de transição e podem se comprometer com o desenvolvimento de células B da zona marginal, também descrito adiante, ou células B foliculares. A afinidade do receptor de células B para antígenos próprios contribui para a diferenciação, em uma célula B folicular ou uma célula B da zona marginal, de uma célula B-2 em maturação. Essa decisão quanto ao destino das células representa um evento de seleção positiva nos linfócitos B, ligado ao comprometimento da linhagem.

FIGURA 8-17 Subgrupos de linfócitos B. A, As células B que se desenvolvem das células-tronco derivadas do fígado fetal diferenciam-se, em sua maioria, na linhagem B-1. B, Os linfócitos B que surgem de precursores da medula óssea após o nascimento dão origem à linhagem B-2. Dois subgrupos importantes de linfócitos B derivam dos precursores da célula B-2. As células B foliculares são linfócitos recirculantes, enquanto as células B da zona marginal são abundantes no baço de roedores, mas também podem ser encontradas nos gânglios linfáticos dos seres humanos.

Células B Foliculares

As células B maduras pertencem, em sua maioria, ao subgrupo de células B foliculares e expressam IgD além das IgM. Cada uma dessas células B coexpressa cadeias pesadas μ e δ que utilizam o mesmo éxon VDJ para gerar o domínio V e se associam à mesma cadeia leve, κ ou λ, para produzir dois receptores de membrana com a mesma especificidade antigênica. A expressão simultânea em uma única célula B que expressa um éxon VDJ rearranjado de especificidade única em dois produtos de transcrição, um deles incluindo éxons C_μ e o outro incluindo éxons C_δ, é obtida por processamento (splicing) alternativo do RNA (Fig. 8-18). O transcrito de RNA é longo e contém a unidade VDJ rearranjada, bem como os genes C_μ e C_δ. Se o produto de transcrição primário for clivado e poliadenilado após os éxons μ, os íntrons são retirados, de modo que o éxon VDJ fique contíguo aos éxons C_μ; isso leva à geração de um mRNA μ. Entretanto, se o complexo VDJ não estiver ligado a éxons C_μ, porém unido a éxons C_δ, ocorre produção de um mRNA δ. A tradução subsequente resulta na síntese de uma proteína completa da cadeia pesada μ ou δ. Assim, a poliadenilação seletiva e o processamento (splicing) alternativo permitem a uma célula B produzir simultaneamente mRNA maduros e proteínas de dois isótipos diferentes de cadeias pesadas. Estão pouco elucidados os mecanismos precisos que regulam a escolha da poliadenilação ou locais aceptores de união por meio dos quais o VDJ rearranjado é unido a C_μ ou C_δ, assim como os sinais que determinam quando e por que uma célula B expressa tanto IgM como IgD, e não apenas IgM. A coexpressão de IgM e de IgD é acompanhada da capacidade de recircular e da aquisição de competência funcional, e esta é a razão pela qual as células B IgM⁺IgD⁺ são também denominadas células B maduras. Essa correlação entre a expressão de IgD e a aquisição de competência funcional levou à sugestão de que a IgD constitui o receptor de ativação essencial das células B maduras. Entretanto, não há evidências de uma diferença funcional entre a IgM e a IgD de membrana. Além disso, deficiência no gene δ das Ig em camundongos não apresenta um impacto significativo sobre a maturação ou as respostas induzidas por antígenos das células B. Com frequência, as células B foliculares são também denominadas células B recirculantes, visto que elas migram de um órgão linfoide para o outro, residindo em focos especializados, conhecidos como folículos de células B (Cap. 2). Nesses nichos, as células B são mantidas, em parte, por sinais de sobrevivência emitidos por uma citocina da família do fator de necrose tumoral (TNF), denominada BAFF ou BlyS (Cap. 11).

FIGURA 8-18 Coexpressão da IgM e da IgD. O processamento alternativo de um produto de transcrição primário do RNA leva à formação de um mRNA μ ou δ. As linhas tracejadas indicam os segmentos da cadeia H unidos por splicing (processamento) do RNA.

As células B maduras virgens são responsivas aos antígenos, e, a não ser que as células encontrem antígenos que reconhecem com alta afinidade e respondem a eles, elas morrem em poucos meses. No Capítulo 11, será descrito como essas células respondem aos antígenos e como o padrão de expressão dos genes da Ig muda durante a diferenciação das células B induzidas por antígenos.

Timócitos Duplo-Negativos

Os timócitos corticais mais imaturos, que chegaram recentemente da medula óssea, contêm genes de TCR em sua configuração de linhagem germinativa e não expressam TCR, CD3, cadeias ζ, CD4 ou CD8; essas células são denominadas timócitos duplo-negativos. Nesse estágio, os timócitos também são considerados como no estágio de maturação de célula pró-T. A maioria (>90%) dos timócitos duplo-negativos que sobrevivem aos processos de seleção do timo dará origem, finalmente, a células T CD4⁺ e CD8⁺ que expressam TCR αβ, restritas pelo MHC, enquanto o restante dará origem a células T γδ. As proteínas Rag-1 e Rag-2 são expressas, pela primeira vez, no estágio de célula pró-T e são necessárias para o rearranjo dos genes do TCR. Os rearranjos D_β-para-J_β no lócus da cadeia β do TCR ocorrem primeiro; envolvem a junção do segmento gênico D_β1 com um dos seis segmentos J_β1, ou a junção do segmento D_β2 com um dos seis segmentos J_β2 (Fig. 8-21A). Os rearranjos V_β-para-DJ_β ocorrem na transição entre o estágio pró-T e o estágio subsequente pré-T durante o desenvolvimento da célula T αβ. As sequências de DNA entre os segmentos que sofrem rearranjo, incluindo os genes D, J e, possivelmente C_β1 (se os segmentos D_β2 e J_β2 forem utilizados), sofrem deleção durante esse processo de rearranjo. Os produtos de transcrição nucleares primários dos genes β do TCR contêm o íntron entre o éxon VDJ_β recombinado e o gene C_β relevante. As caudas de poli-A são acrescentadas após a clivagem do transcrito primário de RNA em regiões suscetíveis à poliadenilação de consenso localizados em 3′ da região C_β, enquanto as sequências entre o éxon VDJ e C_β são emendadas para formar um mRNA maduro, em que os segmentos VDJ estão justapostos a um dos dois genes C_β (dependendo do segmento J que foi selecionado durante o processo de rearranjo). A tradução desse mRNA dá origem a uma proteína da cadeia β do TCR integral. Os dois genes C_β parecem ser intercambiáveis do ponto de vista funcional, e não há evidências de que uma célula T possa mudar de um gene C para outro. Além disso, o uso de qualquer um dos segmentos gênicos C_β não influencia a função nem a especificidade do TCR. Os promotores nas regiões flanqueadoras 5′ dos genes V_β atuam em conjunto com um amplificador potente, localizado em 3′ do gene C_β2, após a aproximação dos genes V com o gene C por recombinação VDJ. Essa proximidade do promotor com o amplificador é responsável pela transcrição específica de alto nível do gene da cadeia β rearranjado do TCR na célula T.

FIGURA 8-21 Recombinação e expressão dos genes das cadeias α e β do TCR. A sequência de recombinação e os eventos da expressão gênica são mostrados para a cadeia β do TCR (A) e para a cadeia α do TCR (B). No exemplo apresentado em A, a região variável (V) da cadeia β do TCR rearranjado inclui os segmentos gênicos V_β1 e D_β1 e o terceiro segmento J no agrupamento J_β1. A região constante (C) é codificada pelo éxon C_β1. Observe que, no lócus da cadeia β do TCR, o rearranjo começa com a junção D-para-J, seguida da junção V-para-DJ. Nos seres humanos, foram identificados 14 segmentos J_β, porém nem todos são mostrados na figura. No exemplo mostrado em B, a região V da cadeia α do TCR inclui o gene Vα1 e o segundo segmento J no grupamento Jα (esse grupamento é composto de pelo menos 61 segmentos Jα nos seres humanos, porém nem todos são mostrados aqui).

Pré-receptor de Células T

Se ocorrer um rearranjo produtivo (i. e., síntese de uma cadeia polipeptídica com estrutura adequada) do gene da cadeia β do TCR em determinada célula pró-T, a proteína da cadeia β do TCR é expressa na superfície celular, em associação a uma proteína invariável, denominada pré-Tα, e às proteínas CD3 e ζ, para formar o receptor de células pré-T (pré-TCR) (Fig. 8-16B). O pré-TCR medeia a seleção das células pré-T em desenvolvimento, que efetuam um rearranjo produtivo da cadeia β do TCR. Cerca da metade de todas as células pré-T em desenvolvimento acrescenta ou remove bases nas junções do rearranjo, que são múltiplas de três (em pelo menos um cromossomo de β do TCR), e, portanto, aproximadamente metade de todas as células pré-T em desenvolvimento não expressa uma proteína β do TCR. A função do complexo pré-TCR no desenvolvimento da célula T é semelhante àquela do pré-BCR contendo cadeias leves substitutas no desenvolvimento das células B. Os sinais do pré-TCR medeiam a sobrevivência das células pré-T e contribuem para a maior expansão da proliferação durante o desenvolvimento das células T. Os sinais do pré-TCR também iniciam a recombinação no lócus da cadeia α do TCR e impulsionam a transição do estágio duplo-negativo de desenvolvimento do timócito para o estágio duplo-positivo (discutido adiante). Esses sinais também inibem o rearranjo adicional do lócus da cadeia β do TCR, limitando, em grande parte, a acessibilidade do outro alelo ao mecanismo de recombinação. Isso resulta na exclusão alélica da cadeia β (i. e., as células T maduras expressam apenas um dos dois alelos da cadeia β herdados). Como nas células pré-B, não se sabe qual ligante, se houver algum, é reconhecido pelo pré-TCR. Em geral, acredita-se que a sinalização do pré-TCR, como na sinalização do pré-BCR, seja iniciada de forma independente do ligante, dependendo do sucesso da montagem do complexo pré-TCR. A sinalização do pré-TCR é mediada por diversas cinases citosólicas e proteínas adaptadoras, também conhecidas pela sua ligação à sinalização do TCR (Cap. 7). A função essencial do pré-TCR na maturação das células T foi demonstrada por numerosos estudos realizados com camundongos, apresentando mutações genéticas, nas quais a falta de qualquer componente do complexo pré-TCR (i. e., a cadeia β do TCR, pré-Tα, CD3, ζ ou Lck) resulta em bloqueio da maturação das células T no estágio duplo-negativo.

Timócitos Duplo-positivos

No próximo estágio das células T, os timócitos expressam tanto CD4 como CD8 e são denominados timócitos duplo-positivos. A expressão de CD4 e CD8 é essencial para os eventos subsequentes de seleção, discutidos mais adiante. O rearranjo dos genes da cadeia α do TCR e a expressão dos heterodímeros αβ do TCR ocorrem na população de células duplo-positivas CD4⁺CD8⁺ pouco depois de a célula sobreviver ao ponto de controle do pré-TCR (Figs. 8-19 e 8-20). Uma segunda onda de expressão do gene Rag no final do estágio pré-T promove a recombinação do gene α do TCR. Como não há nenhum segmento D no lócus α do TCR, o rearranjo consiste apenas na junção dos segmentos V e J (Fig. 8-21B). O grande número de segmento J_α permite a realização de múltiplas tentativas na junção V-J produtiva em cada cromossomo, aumentando, assim, a probabilidade de que um TCR αβ funcional seja produzido. Ao contrário do lócus da cadeia β do TCR, no qual a produção de proteína e a formação do pré-TCR suprimem rearranjos adicionais, existe pouca ou nenhuma exclusão alélica no lócus de cadeia α. Assim, podem ocorrer rearranjos produtivos da cadeia α do TCR em ambos os cromossomos, e, se isso acontecer, a célula T irá expressar duas cadeias α. De fato, até 30% das células T maduras na periferia expressam dois TCR diferentes, com cadeias α diferentes, porém com a mesma cadeia β. É possível que apenas uma das duas cadeias α participe na formação de um complexo funcional entre TCR e o antígeno-específico. A regulação transcricional do gene da cadeia α ocorre de forma semelhante à da cadeia β. Existem promotores em 5′ de cada gene V_α, que possuem baixo nível de atividade e são responsáveis pela transcrição específica de alto nível da célula T quando colocados em proximidade a um amplificador da cadeia α, localizado em 3′ do gene C_α. A incapacidade de efetuar um rearranjo bem-sucedido da cadeia α do TCR, em qualquer um dos cromossomos, leva à falha da seleção positiva (discutida adiante). O timócito incapaz de efetuar um rearranjo produtivo do gene da cadeia α do TCR morre por apoptose.

A expressão do gene α do TCR no estágio duplo-positivo leva à formação do TCR αβ completo, que é expresso na superfície celular, em associação às proteínas CD3 e ζ. A expressão coordenada das proteínas CD3 e ζ e a montagem de complexos de TCR intactos são necessárias para a expressão de superfície. O rearranjo do gene α do TCR resulta em deleção do lócus δ do TCR situado entre os segmentos V (comum a ambos os loci α e δ) e os segmentos J_α (Fig. 8-7). Em consequência, essa célula T não é mais capaz de se transformar em uma célula T γδ e está totalmente comprometida com a linhagem de células T αβ. A expressão dos genes Rag e a recombinação adicional dos genes de TCR cessam após esse estágio de maturação.

As células duplo-positivas que sofrem processos de seleção bem-sucedidos amadurecem em células T CD4⁺ ou CD8⁺, que são denominadas timócitos simples-positivos. Assim, os estágios de maturação das células T no timo podem ser prontamente distinguidos pela expressão de CD4 e CD8 (Fig. 8-22A). Essa maturação fenotípica é acompanhada de maturação funcional. As células CD4⁺ adquirem a capacidade de produzir citocinas em resposta à estimulação antigênica subsequente e a expressar moléculas efetoras (como o ligante CD40), que “ajudam” os linfócitos B, as células dendríticas e os macrófagos, enquanto as células CD8⁺ tornam-se capazes de produzir moléculas que destroem outras células. Os timócitos simples-positivos maduros entram na medula do timo e, em seguida, deixam o timo para residir nos tecidos linfoides periféricos.

FIGURA 8-22 Expressão de CD4 e CD8 nos timócitos e seleção positiva nas células T do timo. A, A maturação dos timócitos pode ser seguida de alterações na expressão dos correceptores CD4 e CD8. A figura ilustra uma análise por citometria de fluxo de duas cores dos timócitos, utilizando anticorpos anti-CD4 e anti-CD8, cada um deles marcado com fluorocromo diferente. A porcentagem de todos os timócitos contribuindo para cada população é mostrada nos quatro quadrantes. O subgrupo menos maduro é constituído pelas células CD4⁻CD8⁻(duplo-negativas). As setas indicam a sequência de maturação. B, Seleção positiva das células T. As células T duplo-positivas diferenciam-se em um estágio CD4⁺CD8^baixo e são instruídas a se transformarem em células CD4⁺ se o TCR em uma célula duplo-positiva reconhecer o MHC de classe II próprio com afinidade moderada e, portanto, receber sinais adequados do correceptor. Uma célula CD4⁺CD8^baixo cujo TCR reconhece moléculas MHC da classe I falha ao receber sinais fortes do correceptor e diferencia-se em uma célula T CD8⁺, silenciando a expressão de CD4.

Seleção Positiva dos Timócitos: Desenvolvimento do Repertório de Células T Restritas pelo MHC Próprio

A seleção positiva é o processo pelo qual os timócitos cujos TCR se ligam com baixa afinidade (i. e., fracamente) a complexos de peptídio próprio-MHC próprio são estimulados a sobreviver (Figs. 8-20 e 8-22). Os timócitos duplo-positivos são produzidos sem qualquer estimulação antigênica e começam a expressar TCR αβ com especificidades geradas de modo aleatório, o que faz com que algumas células T possuam TCR capazes de reconhecer estruturas próprias. No córtex do timo, essas células imaturas encontram células epiteliais, que apresentam uma variedade de peptídeos próprios ligados a moléculas do MHC da classe I e da classe II. O reconhecimento fraco desses complexos de peptídeo próprio-MHC próprio promove a sobrevida das células T. Os timócitos, cujos receptores não reconhecem moléculas do MHC próprio, morrem por uma via de omissão que leva à apoptose; esse fenômeno é denominado morte por negligência (Fig. 8-20). Assim, a seleção positiva assegura que as células T sejam restritas pelo MHC próprio.

Durante a transição das células duplo-positivas para positivas simples, os timócitos com TCR restritos pela classe I transformam-se em células CD8⁺CD4⁻, enquanto as células com TCR restritos pela classe II tornam-se CD4⁺CD8⁻. As células T imaturas duplo-positivas expressam TCR que podem reconhecer o MHC próprio da classe I ou da classe II. Foram propostos dois modelos para explicar o processo de comprometimento com a linhagem, cujo resultado consiste em coreceptores corretamente compatíveis com os TCR que reconhecem uma classe específica de moléculas do MHC. O modelo “estocástico” ou “probabilístico” sugere que o comprometimento das células T imaturas com uma das linhagens depende da probabilidade aleatória de diferenciação de uma célula duplo-positiva em uma célula T CD4⁺ ou CD8⁺. Nesse modelo, uma célula que reconhece o MHC próprio da classe I pode se diferenciar aleatoriamente em uma célula T CD8⁺ (com o coreceptor apropriado) e sobreviver, ou pode se diferenciar aleatoriamente em uma célula T CD4⁺ (com o correceptor “incorreto”), que pode não receber sinais de sobrevida. Nesse processo de diferenciação aleatória em células positivas simples, o coreceptor não é compatível com o reconhecimento da classe correta de moléculas do MHC em cerca de metade das vezes. Uma hipótese mais amplamente aceita é a de que o processo de comprometimento com a linhagem ligada à seleção positiva não é aleatório, porém “instrucional”. Os modelos instrucionais sugerem que os TCR restritos pela classe I e pela classe II emitem sinais diferentes, que induzem ativamente a expressão do coreceptor correto, enquanto eliminam a expressão do outro coreceptor. Sabe-se que as células duplo-positivas passam por um estágio em que expressam altos níveis de CD4 e baixos níveis de CD8. Se o TCR presente nessa célula for restrito pelo MHC da classe I, quando ele identificar o MHC da classe I apropriado e o peptídio próprio, receberá um sinal fraco, visto que os níveis do coreceptor CD8 estão baixos, e, além disso, a molécula de CD8 associa-se bem menos à tirosinocinase Lck do que as CD4. Esses sinais fracos ativam os fatores de transcrição (como o Runx3), que estimulam a expressão de CD8, gerando uma célula T CD8⁺ restrita pela classe I. Por sua vez, se o TCR na célula for restrito pela classe II, quando ele identificar a classe II, receberá um sinal mais potente, visto que os níveis de CD4 estão elevados, e a molécula de CD4 associa-se relativamente bem a Lck. Esses sinais fortes ativam um conjunto diferente de fatores de transcrição (incluindo ThPok), que estimulam a expressão de CD4 e eliminam CD8.

Os peptídeos ligados a moléculas do MHC nas células epiteliais do timo desempenham um papel essencial na seleção positiva. No Capítulo 6, será descrito como as moléculas de superfície celular do MHC da classe I e da classe II sempre contêm peptídeos ligados. Esses peptídeos associados ao MHC nas células apresentadoras de antígenos no timo provavelmente desempenham dois papéis na seleção positiva – em primeiro lugar, promovem a expressão estável das moléculas do MHC na superfície celular, e, em segundo lugar, podem influenciar as especificidades das células T selecionadas. É também evidente, de uma variedade de estudos experimentais, que alguns peptídeos são melhores do que outros para sustentar a seleção positiva, e diferentes peptídeos diferem nos repertórios de células T que eles selecionam. Esses resultados sugerem que o reconhecimento de um antígeno específico, e não apenas o reconhecimento de MHC, desempenha algum papel na seleção positiva. Uma consequência da seleção positiva induzida por peptídeos próprios é que as células que amadurecem têm a capacidade de reconhecer os peptídeos próprios. No Capítulo 2, abordou-se que a sobrevida dos linfócitos virgens antes de seu encontro com antígenos estranhos requer sinais de sobrevivência, aparentemente gerados pelo reconhecimento de antígenos próprios nos órgãos linfoides periféricos. Os mesmos peptídeos próprios que medeiam a seleção positiva dos timócitos duplo-positivos no timo podem estar envolvidos na manutenção das células T maduras (positivas simples) virgens vivas nos órgãos periféricos, como os gânglios linfáticos e o baço.

O modelo de seleção positiva com base no reconhecimento fraco de antígenos próprios levanta uma questão fundamental: como a seleção positiva, impulsionada por antígenos próprios, produz um repertório de células T maduras específicas para antígenos estranhos? A resposta provável é que a seleção positiva permite a sobrevida e a diferenciação de muitos clones diferentes de células T, e muitas dessas células T, que reconhecem peptídeos próprios com baixa afinidade, irão, após a sua maturação, reconhecer de modo casual peptídeos estranhos com afinidade alta o suficiente para serem ativados e gerar respostas imunológicas.

Seleção Negativa dos Timócitos: Tolerância Central

Os timócitos cujos receptores reconhecem, com alta afinidade, complexos de peptídio-MHC no timo sofrem apoptose (denominada seleção negativa) ou diferenciam-se em células T reguladoras (Fig. 8-20). Entre as células T duplo-positivas geradas no timo, algumas podem expressar TCR que reconhecem antígenos próprios com alta afinidade. Os peptídeos presentes no timo são autopeptídios, derivados de antígenos proteicos amplamente expressos, bem como de algumas proteínas que, acredita-se, sejam restritas a determinados tecidos. (Lembre-se de que os micro-organismos que entram através das vias comuns, isto é, os epitélios, são capturados e transportados até os gânglios linfáticos e não tendem a entrar no timo.) Nas células T imaturas, uma importante consequência do reconhecimento do antígeno com alta afinidade é a deflagração do processo de apoptose, que leva à morte ou à deleção das células. Assim, muitos dos timócitos imaturos que expressam receptores de alta afinidade para antígenos próprios no timo são eliminados, resultando na seleção negativa do repertório de células T. Esse processo elimina as células T potencialmente autorreativas mais nocivas e constitui um dos mecanismos que assegura que o sistema imune não irá responder a muitos antígenos próprios, denominado autotolerância. A tolerância induzida nos linfócitos imaturos pelo reconhecimento de antígenos próprios nos órgãos linfoides geradores (ou centrais) é também denominada tolerância central, para contrastá-la com a tolerância periférica induzida nos linfócitos maduros por antígenos próprios nos tecidos periféricos. No Capítulo 14, serão discutidos com mais detalhes os mecanismos e a importância fisiológica da intolerância imunológica.

A deleção das células T imaturas autorreativas pode ocorrer tanto no estágio duplo-positivo no córtex como em células T simples-positivas recém-geradas na medula. As células apresentadoras de antígenos no timo que medeiam a seleção negativa consistem principalmente em células dendríticas e macrófagos derivados da medula óssea, ambos abundantes na medula, e em células epiteliais da medula do timo, enquanto as células epiteliais corticais são especialmente (e talvez,únicas) efetivas na indução da seleção positiva. As células T duplo-positivas são atraídas até a medula do timo pelas quimiocinas específicas do CCR7, a CCL21 e a CCL19. Na medula, as células epiteliais medulares do timo expressam uma proteína nuclear, denominada AIRE (regulador autoimune), que induz a expressão de diversos genes específicos de diferentes tecidos no timo. Os produtos desses genes são expressos normalmente apenas em órgãos periféricos específicos, como o pâncreas e a tireoide. A expressão dessas moléculas dependentes do AIRE no timo permite que sejam disponibilizados muitos peptídeos específicos de tecidos para a sua apresentação às células T em desenvolvimento, facilitando a deleção (seleção negativa) dessas células. Uma mutação no gene que codifica o AIRE resulta em uma síndrome poliendócrina autoimune, ressaltando a importância do AIRE em mediar a tolerância central a antígenos específicos de tecidos (Cap. 14).

O mecanismo da seleção negativa no timo é a indução da morte por apoptose. Ao contrário do fenômeno de morte por negligência que ocorre na ausência de seleção positiva, na seleção negativa, são gerados sinais ativos que promovem a morte quando o TCR dos timócitos imaturos liga-se com alta afinidade a um antígeno. A indução de uma proteína pró-apoptótica, denominada Bim, pela sinalização do TCR provavelmente desempenha um papel crucial na indução da permeabilidade mitocondrial e na apoptose dos timócitos durante a seleção negativa (Cap. 14). É também evidente que o reconhecimento de um antígeno com alta afinidade pelas células T imaturas deflagra o processo de apoptose; entretanto, o reconhecimento desses mesmos peptídeos pelos linfócitos maduros (em associação a outros sinais, Cap. 9) inicia respostas das células T. A base bioquímica dessa diferença fundamental ainda não foi definida.

Reconhecimento de antígenos próprios no timo pode gerar uma população de células T reguladoras, cuja função é impedir a ocorrência de reações autoimunes (Cap. 14). Não foi esclarecido quais fatores determinam a escolha entre os dois destinos alternativos das células T imaturas que reconhecem antígenos próprios com alta afinidade, isto é, a deleção das células T imaturas e o desenvolvimento das células T reguladoras. É possível que interações de afinidade ligeiramente menores do que as necessárias para a deleção possam levar ao desenvolvimento das células T reguladoras naturais, porém é necessário obter evidências claras para essa hipótese.